Uvod: Dipeptidil peptidaza IV (DPPIV) ali označevalec CD26 je membranski glikoprotein, ki je prisoten tako na površini epitelijskih, endotelijskih in acinarnih celic različnih tkiv, kot tudi krvnih celic, predvsem limfocitov T. Ima pomembno vlogo v regulaciji diferenciacije in rasti limfocitov T, udeležen pa je tudi pri signalizaciji. Izražanje označevalca CD26 je na limfocitih T v mirujočem stanju nizko, se močno poveča po njihovi aktivaciji in doseže maksimum po treh dneh. Pomembno vlogo pri regulaciji izražanja imajo citokini. Njihova prisotnost v okolju namreč vpliva na to, v kateri tip celic pomagalk se bodo razvile naivne CD4+ celice. Vplivajo tudi na regulacijo izražanja označevalca CD26 na površini limfocitov T. Izražanje je zmanjšano na celicah Th2 in povečano na celicah Th1 in Th17, z največjim izražanjem na Th17 populaciji. Namen: Namen študije je bil določiti izražanje označevalca CD26 na površini in v notranjosti različnih podvrst celic T pomagalk (Th0, Th1, Th2, Th17). Ker so bile študije o izražanju označevalca CD26 na površini različnih celic T pomagalk že narejene, je bil naš glavni namen najti povezavo med membranskim in znotrajceličnim izražanjem. Med zastavljenimi cilji je bila tudi ugotovitev, ali je izolacija CD4+ celic za tovrstno analizo potrebna, in določitev izločanja encima z membrane v medij s testom ELISA ter testom encimske aktivnosti. Metode: Celice smo pridobili 1) iz periferne krvi treh zdravih prostovoljcev z izolacijo perifernih mononuklearnih celic (PBMC) s pomočjo gradientnega centrifugiranja s fikolom oz. 2) s postopkom odmrznitve že izoliranih PBMC šestih zdravih prostovoljcev, pridobljenih iz celične banke laboratorija. V primeru izolacije celic iz krvi smo izvedli tudi magnetno pogojeno ločevanje CD4+ celic, v primeru odmrznitve celic pa tega ločevanja nismo izvedli. Po izolaciji celic smo te suspendirali v gojitvenem mediju in jim dodali anti-CD3/anti-CD28 aktivator limfocitov T ter citokine za diferenciacijo: IL-12 in protitelesa za nevtralizacijo IL-4 za Th1 diferenciacijo; IL-4 in protitelesa za nevtralizacijo IL-12 za Th2 diferenciacijo; IL-1β, IL-23 in protitelesa za nevtralizacijo IL-4 ter IFNγ za Th17 diferenciacijo. V primeru Th0 diferenciacije v medij nismo dodali citokinov. Celice smo inkubirali 3 dni pri temperaturi 37 °C in atmosferi s 5 % CO2. Po inkubaciji smo celice pripravili za označevanje s protitelesi. Za analizo prisotnosti označevalca CD26 na površini celic smo celice označili s primarnimi s fluorokromi označenimi protitelesi proti CD3 (označena s PerCP), CD4 (označena z APC), CD45RO (označena s FITC) in CD26 (označena s PE). Za analizo prisotnosti označevalca CD26 v notranjosti celic smo te najprej fiksirali in permealizirali ter jih nato označili s primarnimi s fluorokromi označenimi protitelesi proti označevalcu CD26 (označena s FITC). Za vsak vzorec smo pripravili tudi kontrolo, v katero nismo dodajali protiteles. Tako pripravljene suspenzije celic smo analizirali s pretočnim citometrom s štirimi fluorescenčnimi detektorji. Prisotnost encima v gojitvenem mediju smo določili s sendvič testom ELISA z encimskim zaznavnim sistemom hrenove peroksidaze, encimsko aktivnost pa z uporabo substrata Gly-Pro-p-nitroanilida, ki ob prisotnosti DPPIV hidrolizira v Gly-Pro in p-nitroanilin (p-NA), ta pa absorbira pri valovni dolžini 405 nm. Encimska aktivnost je bila podana kot količina nastalega produkta (p-NA) na minuto. Rezultati in razprava: Celice smo analizirali s pretočno citometrijo, s pomočjo katere smo izmerili intenziteto fluorescence, ki je odvisna od količine označenih protiteles, vezanih na ciljne označevalce, in posledično prisotnost označevalcev na površini celic oz. v njihovi notranjosti. Pri analizi označevalca CD26 na površini celic T pomagalk smo limfocite analizirali glede na prisotnost membranskih označevalcev CD3, CD4, CD45RO in CD26, pri znotrajcelični analizi pa le glede na prisotnost označevalca CD26. Povprečno 47,25 % aktiviranih celic T pomagalk je izražalo označevalec CD26 na površini pri Th2 tipu celic, 37,51 % pri Th0 tipu celic, 29,96 % pri Th17 tipu celic in 17,85 % pri Th1 tipu celic, brez statistično značilnih razlik med njimi. Mediana intenzitete fluorescence je bila najvišja pri Th17 populaciji in najnižja pri Th2 populaciji, s statistično značilno razliko med njima, kar se je skladalo z dosedanjimi študijami. V primerjavi s celicami brez dodanih citokinov (Th0), Th1 celice niso izražale povečanega izražanja označevalca na površini, kot je bilo dokazano v dosedanjih študijah, ampak je bilo izražanje nižje. Pri znotrajcelični analizi deležev CD26+ limfocitov nismo mogli primerjati med seboj zaradi različnih izolacijskih postopkov. Mediana intenzitete fluorescence znotrajceličnega označevalca CD26 je bila najvišja pri podvrsti Th1, kateri sta sledili podvrsti Th0 in Th2. Najnižje izražanje označevalca je bilo opaženo pri populaciji Th17. Rezultati se niso ujemali z našimi pričakovanji in niso podprli teorije, da bo imela podvrsta celic pomagalk z največjim membranskim izražanjem, zaradi večjega prenosa proteina na celično membrano, najmanjše znotrajcelično izražanje. To se je pokazalo le pri celicah Th17, ki so imele največje površinsko in najmanjše znotrajcelično izražanje označevalca CD26. Za vse ostale podvrste celic T pomagalk to ni veljalo. Ugotovili smo, da pri analizi površinskega izražanja označevalca izolacija CD4+ celic ni bila ključnega pomena, saj smo celice analizirali tudi glede na površinske označevalce CD3, CD4 in CD45RO ter na ta način določili tarčno populacijo (aktivirane celice T pomagalke). Pri znotrajcelični analizi je bila izolacija veliko pomembnejša, saj ostalih označevalcev nismo določali in je bil zato pri neizolirani populaciji delež CD26+ celic veliko manjši v primerjavi z deležem pri izolirani populaciji. Zaradi različnih izolacijskih postopkov je bila primerjava deleža CD26+ celic med podvrstami celic T pomagalk nemogoča. Prisotnost DPPIV v gojitvenem mediju je bila pod mejo detekcije v večini vzorcev tako pri testu ELISA, kot tudi pri testu encimske aktivnosti. Ti rezultati nakazujejo, da je bilo izločanje encima v medij po treh dneh od aktivacije limfocitov T zanemarljivo. Razlog za to je lahko v relativno kratki inkubaciji celic. Po treh dneh doseže izražanje označevalca na površini celic maksimum, zato predvidevamo, da v tej fazi še ne pride do velikega izločanja označevalca CD26 z membrane v medij. Zaključek: Pod danimi pogoji nam povezave med membranskim in znotrajceličnim izražanjem označevalca CD26 ni uspelo najti, smo pa kljub temu med raziskavo prišli do drugih pomembnih ugotovitev. Ugotovili smo, da je za znotrajcelično analizo označevalca pomembna izolacija CD4+ populacije in da je po treh dneh od aktivacije limfocitov T, ko je izražanje označevalca CD26 na membrani največje, izločanje le-tega v medij zanemarljivo. Zaradi statistično neznačilnih razlik v izražanju znotrajceličnega označevalca CD26 med posameznimi podvrstami celic T pomagalk, in ker rezultati nakazujejo na vpliv intraindividualnih razlik v izražanju označevalca CD26, bi večje število prostovoljcev, vključenih v študijo, pomembno vplivalo na rezultate. Možno pa je tudi, da je dinamika sinteze in izražanja označevalca CD26 drugačna, kot smo predpostavljali.
|
