Genomika je z napredkom v DNK sekvenciranju, skupaj z bioinformatiko in genomskim rudarjenjem (angl. genome mining), omogočila pospešeno odkrivanje novih naravnih produktov. Tako je D. A. Mitchell s sodelavci nedavno poročal o odkritju novega razreda naravnih produktov, ki pripadajo skupini ribosomalno sintetiziranih in post-translacijsko modificiranih peptidov (angl. ribosomally synthesized and post‑translationally modified peptides; RiPPs). Genski zapis za njihovo biosintezo je bil odkrit v genomu organizma Micromonospora rosaria. Zapis za nekatere encime, udeležene pri biosintezi omenjenih novih naravnih produktov, je podoben, kot ga najdemo v genskem zapisu za sintezo tiomuracinov (angl. thiomuracins). Struktura novih produktov je bila predvidena na podlagi teh podobnosti in tudi lastnosti, da iz genskega zapisa za ribosomalno sintetizirane in post-translacijsko modificirane peptide lahko zelo dobro napovemo njihovo strukturo. Piritidi, kot so bili novi naravni produkti poimenovani, imajo makrociklično peptidno strukturo, ki vsebuje substituirano piridinsko jedro. Kemijska karakterizacija enega izmed produktov je zahtevala njegovo neodvisno totalno kemijsko sintezo.
Z retrosintezno analizo piritida A2 (angl. pyritide A2) je raziskovalna skupina D. Šarlaha in sodelavcev strukturo produkta razdelila na dva peptidna fragmenta ter trisubstituirano piridinsko jedro. Možne poti za sintezo slednjega smo preučili v magistrskem delu, glavni izziv pa je predstavljala namestitev stranske skupine, ki izvira iz arginina. Substituirane piridine sicer lahko sintetiziramo na dva glavna načina - s substitucijo na piridinskem skeletu ali z de novo sintezo.
Alkiliranje na mestu 2 piridinskega skeleta je bilo načrtovano z uporabo reackcije tipa Minisci. V nedavno objavljenem literaturnem postopku so bili pod fotokatalitskimi pogoji, ob prisotnosti iridijevega fotokatalizatorja, kot prekurzorji nukleofilnih ogljikovih radikalov uporabljeni N-hidroksibenzimidoil klorid estri (angl. N‑hydroxybenzimidoyl chloride esters; NHBC esters), alkiliranje pa je poteklo na mestu 2 pri različnih dušik-vsebujočih heterociklih. Paralelno smo izvedli kontrolni poskus, ponovljen iz literature, ter modelni poskus pri katerem smo za heterociklični substrat izbrali disubstituiran piridin. V obeh poskusih smo N-hidroksibenzimidoil klorid ester v treh korakih pripravili iz N-Boc-L-fenilalanina. Preliminarni rezultati za modelni sistem so pokazali, da želeni produkt ni bil prisoten niti v sledeh. Na podlagi teh rezultatov in radikalskega mehanizma, ki bi pomenil izgubo stereokemijske informacije (ki izvira iz amino kisline), smo omenjeno sintezno pot opustili.
Druga sintezna strategija je temeljila na de novo sintezi piridinov. Ker bo končni 2,3,6‑trisubstituirani piridinski produkt udeležen v nadaljnjih reakcijah peptidnega spajanja (angl. peptide coupling), smo morali izbrati ustrezne zaščitne skupine za dve karboksilni skupini (etilna, 2-(trimetilsilil)etilna in 2,2,2-trikloroetilna zaščitna skupina) ter α-amino in gvanidino skupini, izvirajoči iz arginina, (tert-butoksikarbonil in benziloksikarbonil zaščitni skupini). Ortogonalne zaščitne skupine bi omogočile njihovo selektivno odstranitev in želeno reaktivnost v nadaljnjih pretvorbah.
Za raziskovanje učinkovitosti poskusnih pretvorb smo zasnovali modelni sistem, temelječ na N‑Boc-L-fenilalaninu, rezultate pa smo nato prenašali na realni sistem, temelječ na Nα‑Boc-Nω,Nω'-bis(Cbz)-argininu.
Iz 2-bromoacetil bromida smo sprva v treh korakih (sinteza estra z ustreznim alkoholom, substitucija s trifenilfosfinom ter deprotoniranje z bazo) pripravili ustrezne O-zaščitene fosforjeve ilide. Te smo v naslednjem koraku spajali z aminokislinami ob prisotnosti reagentov za peptidno spajanje. Pri tem smo testirali učinkovitost različnih reagentov za spajanje. Najprej smo v obeh sistemih (modelnem in realnem) uporabili le O-etil zaščitene ilide. EDC, ki je sicer široko uporabljen reagent za spajanje, je dal ob prisotnosti DMAP in dveh ekvivalentov ilida zelo dobre rezultate na modelnem sistemu (izkoristek do 86%). Pri uporabi istih pogojev smo na realnem sistemu opazili občutno manjši izkoristek (53%). Pri poskusu optimizacije reakcijskih pogojev smo zaznali primerljive ali kvečjemu nižje izkoristke. Uporaba CDI je, kljub poskusu optimizacije reakcijskih pogojev, dala zelo nizke, največ 30‑odstotne izkoristke.
Pri obeh sistemih (modelnem in realnem) je HATU izkazal dobre izkoristke pri reakciji v CH2Cl2, medtem ko so bili pri reakciji v DMF izkoristki nekoliko nižji. Podobno se je pri reakciji v CH2Cl2 in DMF izkazal PyAOP. Slednji je sicer dosegel nekoliko boljši izkoristek pri realnem sistemu (73%). Na podlagi teh rezultatov smo se odločili za optimizacijo reakcijskih pogojev z uporabo PyAOP. Ko je bil le-ta uporabljen v množini 1,1–1,2 ekvivalenta glede na aminokislino, pri koncentraciji 0,2 M v CH2Cl2 in ob prisotnosti treh ekvivalentov baze DIPEA, smo pri modelnem sistemu količino ilida lahko zmanjšali z dveh na 1,1 ekvivalenta in ohranili izkoristek v območju 80%. Pri realnem sistemu se je izkoristek v tem primeru zmanjšal za četrtino, zato smo optimalen rezultat (okoli 80%) dosegli z dvema ekvivalentoma ilida ter ga v tem območju ohranili tudi na večji skali.
Z optimiziranimi reakcijskimi pogoji sinteze s PyAOP smo nadaljevali spajanje med argininom ter 2-(trimetilsilil)etil in 2,2,2-trikloroetil O-zaščitenima ilidoma. Slednja nista bila v obliki trdnih kristaliničnih produktov, zato smo se odločili, da ju pripravimo in situ iz fosfonijevih soli ob dodatku večje količine baze. Pri tem smo dosegli solidne izkoristke za 2-(trimetilsilil)etilno zaščito (59–73%) ter sprejemljive izkoristke za 2,2,2‑trikloroetilno zaščito (40–50%). V obeh primerih pa je bilo opaziti zmanjšanje izkoristka pri povečanju reakcijske skale.
Pripravljeni stabilizirani fosforjevi ilidi so hkrati maskirali vicinalni trikarbonilni motiv, ki je bil razkrit po oksidativni cepitvi vezi med ogljikom in fosforjem. Najbolje se je izmed preizkušenih oksidantov izkazal ozon. Z ozonolizo smo pri −78 °C v CH2Cl2 dosegli popolno konverzijo reaktanta, vendar smo pri tem ugotovili, da stranski produkti nastajajo ne glede na njeno postopnost. Samih vicinalnih trikarbonilov nismo uspeli izolirati, njihova stabilnost je vprašljiva. Kljub težavam pri uporabi ozona pa smo le z njim dosegli popolno konverzijo reaktantov, produkte smo za nadaljnje pretvorbe uporabili nemudoma in brez predhodne izolacije. Ostali oksidanti, ki smo jih preizkusili (Oxone, NaIO4, mCPBA, Davisov oksaziridin), so v različnih topilih pod različnimi pogoji v daljših reakcijskih časih dosegli zelo slabo konverzijo reaktantov.
Ločeno smo iz etil 2-amino-2-oksoacetata v dveh korakih, v prvem koraku z Lawessonovim reagentom in v drugem koraku s hidrazinom, pripravili ustrezni amidrazon. Nato smo vicinalne trikarbonilne spojine z enolončnim (angl. one-pot) procesom v dveh korakih pretvorili v 2,3,6-trisubstituirane piridine. Amidrazon je pri kondenzaciji s surovimi vicinalnimi trikarbonili formiral trisubstituirane 1,2,4‑triazine. Njihova nadaljnja aza-Diels–Alderjeva reakcija z 2,5-norbornadienom (angl. 2,5‑norbornadiene), eliminacija dušika in rearomatizacija so pripeljale do sinteze želenih piridinov. Po optimizaciji reakcijskih pogojev in in situ priprave amidrazona (iz etil 2‑amino‑2‑tiooksoacetata in hidrazina) je enolončni proces potekal 1–2 h pri sobni temperaturi in nato 20–21 h pri 60 °C. Pri tem smo se soočili z nizkimi izkoristki pretvorb (37% za modelni ter 14–25% za realni sistem; reaktanti v obeh sistemih so bili pripojeni fosfonijevi ilidi), ki so lahko posledica različnih dejavnikov (nestabilnost substratov, reaktivnost stranskih produktov, reakcijski pogoji). Kljub vsemu pa smo dokazali, da so želeni 2,3,6-trisubstituirani piridini sintezno dostopni, a hkrati ostaja prostor za izboljšave reakcijskih pogojev, ki bi vodili v boljše izkoristke pretvorb.
|
