Kompleksna tridimenzionalna zgradba terapevtskih proteinov in njihova nagnjenost k agregaciji so velik izziv za biofarmacevtska podjetja, saj lahko proteinski agregati vzbudijo imunske reakcije, prekinejo pretok manjših žil in vodijo k zmanjšanju količine proteinskih monomerov, ki so odgovorni za terapevtski učinek. Proteinski agregati so skupki proteinskih monomerov, ki se lahko razlikujejo v velikosti, strukturi in reverzibilnosti. Njihov nastanek lahko sproži nihanje temperature, neugoden pH, prisotnost oksidativnih radikalov ali pa mehanski stres, kot je na primer tresenje, mešanje, strižne sile ali padec na trdno podlago. Znanih je več mehanizmov tvorbe proteinskih agregatov. Eden najpomembnejših je agregacija na mejnih površinah, kjer pride do konformacijske spremembe proteina zaradi adsorpcije na medfazo (npr. zrak-tekočina ali trdna snov-tekočina). Spremembe v strukturi proteina (sekundarne, terciarne, kvarterne zgradbe) vodijo do odkrivanja hidrofobnih področij, ki so bolj dovzetna za interakcije kot površina nativne konformacije proteina. Deformirana struktura proteina služi kot povod za agregacijo na medfazi. Agregacija na medfazi je še posebej močno izražena v kombinaciji z mehanskim stresom, ki prekine adsorbiran film proteina na medfazi in proteinske agregate prenese v raztopino, kjer le-ti sprožijo nadaljnjo agregacijo.
Polisorbati so površinsko aktivne snovi, ki so pogosto prisotne v formulacijah s proteini z namenom preprečevanja agregacije. So heterogene zmesi mono- ali poli-estrov polioksietiliranega sorbitana z višjimi maščobnimi kislinami. Številne študije opisujejo mehanizem njihovega delovanja v smislu preprečevanja agregacije. Adsorpcija polisorbatov na mejne površine in s tem kompetitivno zaviranje adsorpcije proteina na le-te je glavna pot preprečevanja agregacije. Poleg tega sta v literaturi opisana še dva mehanizma. Prvi predpostavlja vezavo polisorbatov na hidrofobna področja proteina. Na ta način pride do zmanjšanja interakcij med samimi proteini ter med proteinom in medfazo. Drugi pa predpostavlja, da je delovanje polisorbatov podobno molekularnim šaperonom, ki proteinu olajšajo in omogočijo spremembo konformacije nazaj v nativno.
Čeprav je mehanizem delovanja polisorbatov dobro raziskan, še vedno ni popolnoma jasno, kako različne stopnje kakovosti, ki ustrezajo specifikacijam iz različnih farmakopej, vplivajo na stabilnost proteinskih formulacij. Vpliv razgradnih produktov polisorbatov na stabilnost proteinov prav tako ni dobro raziskan. Znano pa je, da so polisorbati nagnjeni k razgradnji, najpogosteje po oksidativni poti zaradi faktorjev kot so UV svetloba, prisotnost reaktivnih kisikovih zvrsti in kontaminacije s prehodnimi kovinami (Fe, Cu). Druga možna pot razgradnje je hidroliza, ki v farmacevtsko relevantnih pogojih poteče zaradi encimov, ki izhajajo iz celic, uporabljenih v proizvodnem procesu in so prisotni zaradi nezadostnega čiščenja proteina.
V magistrskem delu je bilo monoklonsko protitelo IgG izpostavljeno mehanskemu stresu treh različnih izvorov. Prvi mehanski stres je bil povzročen s črpanjem raztopine v sistemu dveh injekcij, ki sta bili povezani s kapilaro. Za vzbuditev drugega mehanskega stresa smo uporabili mešalnik s 96 individualnimi mešalnimi lopaticami. Zadnji mehanski stres smo povzročili s prostim padom viale na trdno podlago. Le prva metoda mehanskega stresa je bila ustrezna za primerjavo vpliva različnih koncentracij, stopenj kakovosti in razgradnih produktov polisorbata 80 na stabilnost monoklonskega protitelesa, kar je bil tudi namen te magistrske naloge.
Uporabljenemu proteinu smo dodali polisorbat 80 dveh različnih stopenj kakovosti. Prva stopnja kakovosti je ustrezala specifikacijam evropske, ameriške in japonske farmakopeje, druga pa strožjim specifikacijam kitajske farmakopeje. Modelnemu proteinu smo dodali tudi (delno) razgrajen polisorbat 80, ki je bil pripravljen z bazično katalizirano hidrolizo. Uspešnost razgradnje polisorbata 80 je bila ovrednotena s tekočinsko kromatografijo, sklopljeno z detektorjem CAD (LC-CAD). Vpliv površinsko aktivne snovi na stabilizacijo proteina je bil analiziran z merjenjem stopnje njegove agregacije. Delci v nano- in mikro-metrskem velikostnem razredu so bili proučeni z metodami, kot so pretočna mikroskopija (MFI), slikovna obdelava z membrano v ozadju (BMI) in dinamičnim sipanjem laserske svetlobe (DLS). Poleg tega smo motnost raztopine določali z UV-spektroskopijo, topne agregate pa z velikostno izključitveno kromatografijo ultra visoke ločljivosti (UP-SEC).
Z metodo črpanja smo določili območje koncentracij polisorbata 80, kjer je le-ta učinkovit pri preprečevanju agregacije proteina. Za stabilizacijo proteina je bila potrebna koncentracija 0.004 % (m/V) polisorbata 80. Ugotovili smo tudi, da je uporaba koncentracij polisorbata 80 pod kritično micelarno koncentracijo (< 0.0017 % m/V) lahko neugodna. Za te raztopine smo namreč po stresu pri nekaterih ponovitvah določili večjo število agregatov v primerjavi z raztopino brez dodatka polisorbata. Z uporabo iste metode za vzbuditev mehanskega stresa smo primerjali tudi delovanje polisorbata 80 dveh različnih stopenj kakovosti pri treh izbranih koncentracijah. Polisorbat 80 je protein stabiliziral v podobni meri pri obeh stopnjah kakovosti in vseh treh preizkušenih koncentracijah. Za metodo s črpanjem je bila ugotovljena velika deviacija med posameznimi ponovitvami, zato predlagamo ponovitev poskusov s polisorbatom 80 različnih stopenj kakovosti s ponovljivo metodo mehanskega stresa. Literatura prikazuje, da polisorbat 80, ki ustreza kitajski farmakopeji oksidira hitreje kot polisrbat 80 druge uporabljene kakovosti. Iz tega vidika bi bilo potrebno izvesti nadaljnje poskuse z uporabo oksidiranega polisorbata 80 in ugotavljanjem njegove aktivnosti.
Pri analizi hidroliziranega polisorbata 80 smo ugotovili, da je prišlo do popolne hidrolize, saj je bil signal mono- in poli-estrov polisorbata 80 zanemarljiv v primerjavi z nerazgrajeno obliko. Dodatni signali v kromatogramu razgrajenega polisorbata 80 so najverjetneje pripadali prostim maščobnim kislinam. To domnevo smo potrdili z MFI, ki je zaznala veliko število majhnih delcev, ter z BMI. Proste maščobne kisline so lipofilne, zato jih BMI membrana prepušča, kar je bilo v literaturi opaženo že za kapljice silikonskega olja.
Vpliv razgrajenega polisorbata 80 na stabilnost proteina smo preizkušali z mehanskim stresom, povzročenim s črpanjem. Ugotovili smo, da popolnoma razgrajen polisorbat 80 ne prepreči agregacije, saj smo z MFI in BMI določili zelo veliko število nastalih agregatov. Pomanjkanje učinkovitosti polisorbata 80 lahko pripišemo izgubi amfifilnega značaja.
V nadaljevanju smo razgrajenemu polisorbatu 80 pri nespremenjeni celokupni koncentraciji dodajali večji delež nerazgrajenega polisorbata. Šele pri 90 % deležu nerazgrajenega polisorbata 80 je bilo število delcev enako kot pri 100 % nerazgrajeni obliki. Iz tega lahko razberemo, da imamo lahko le ~10 % razgrajenega polisorbata 80 za želen stabilizacijski učinek. V naslednjem poskusu smo stalni koncentraciji nerazgrajenega polisorbata 80 dodajali različno količino razgradnih produktov. Večja količina dodanih razgradnih produktov je povzročila nastanek večjega števila proteinskih agregatov. To pomeni, da prisotnost večje koncentracije razgradnih produktov (prostih maščobnih kislin) negativno vpliva na stabilnost monoklonskega protitelesa.
Na podlagi naših rezultatov in obstoječe literature predlagamo, da je koncentracijo polisorbata 80 potrebno izbrati zelo skrbno. Prenizka koncentracija je lahko neučinkovita ali celo negativno vpliva na stabilnost proteina. V primeru previsoke koncentracije pa le-ta sodeč po literaturi lahko povzroči hitrejšo razgradnjo/agregacijo proteina. S časom pa pri večjih koncentracijah tvegamo tudi prisotnost večjega števila razgradnih produktov, ki imajo prav tako neugoden vpliv na stabilnost proteinskih formulacij.
|
