Vpliv inzulinu podobnega rastnega dejavnika-1 in endotelina-1 na izločanje vnetnih citokinov iz celic glije

Brišnik, Vita (author), Kržan, Mojca (mentor), Kooijman, Ron (co-mentor)

RAZŠIRJENI POVZETEK Možganska kap je eden izmed vodilnih vzrokov umrljivosti in invalidnosti po celem svetu. Je nenaden dogodek, ki nastane zaradi zapore ali razpoke krvne žile v možganih. Zdravljenje akutne ishemične možganske kapi poteka intravensko z raztapljanjem krvnega strdka z rekombinantnim tkivnim aktivatorjem plazminogena. Tromboliza je uspešna metoda zdravljenja le, če je opravljena znotraj 4,5 ur. Zaradi časovne omejitve in kontraindikacij za trombolizo le manjšina pacientov koristi to možnost zdravljenja. Prav zato se iščejo novi načini zdravljenja. Ob nastanku ishemične kapi glede na količino preostalega pretoka krvi obstajata dve območji poškodbe. Sredica ishemije, kjer med celicami prevladuje nekroza, pride do niza biokemičnih dogodkov, ki vodijo do razpada celičnih membran in propada nevronov, in območje okoli nje, ki se imenuje penumbra. Za to območje je značilna zmanjšana, a še ohranjena prekrvavitev tkiva. V penumbi prevladuje programirana celična smrt (apopotoza) kot prevladujoča oblika celične smrti. Zelo pomembno je dejstvo, da lahko penumbra ostane viabilna 16-48 ur po kapi, zato je čimprejšnja reperfuzija izrednega pomena. Za zgodnje dogodke po ishemiji je značilno, da jih je zelo težko preprečiti, sploh ker nastopijo le nekaj minut po kapi. Kasnejši dogodki se začnejo po nekaj urah ali celo nekaj dneh in vključujejo možgansko vnetje in apoptozo. V območju ishemije pride do aktivacije mikroglije in astrocitov, posledičnega izločanja citokinov in infiltracije perifernih levkocitov. Ravno ti dogodki še dodatno poslabšajo poškodbo možganov in so odgovorni za večino celične smrti v penumbri. Kasnejši dogodki predstavljajo pomembno tarčo pri zdravljenju kapi. Mikroglija so rezidentni makrogafi centralnega živčnega sistem in so odgovorni za imunsko obrambo možganov. Njihova posebnost je hitra aktivacija v primeru patoloških sprememb ali poškodb v centralnem živčevju, kot so možgansko vnetje, ishemija, možganski tumorji ali nevrodegenerativnost. Ker so te celice prve, ki se odzovejo na možgansko poškodbo, so privlačile veliko pozornosti v predkliničnih študijah in predstavljajo zelo pomembno tarčo za nove terapevtske pristope k preprečevanje možganske poškodbe. S fagocitiranjem tujih celic in ostankov celic ohranjajo ravnovesje v možganih. Aktivirana mikroglija izloča vnetne citokine in prispeva k vnetju, izloča pa tudi nevroprotektive faktorje in protivnetne citokine ter tako spodbuja obnovo tkiva. Aktivacija mikroglije pripomore k fagocitozi nekrotičnih in apoptotičnih nevronov ter spodbuja nevrogenezo. Astrociti so najštevilčnejši predstavniki nevroglije in so odgovorni za vzdrževanje intaktnosti krvno-možganske pregrade. Poleg tega so odgovorni za metabolično preskrbo nevronov in urejanje pretoka krvi v možgane. Poleg teh fizioloških vlog pa so astrociti vpleteni tudi v patološke procese. Ishemija povzroči tako imenovano reaktivno gliozo. Reaktivni astrociti pripomorejo k možganskemu vnetju z izločanjem citokinov, kot so TNF-?, IL-1?, IL-6. Inzulinu-podoben rastni dejavnik-1 (IGF-1) izkazuje nevroprotektivne učinke v različnih eksperimentalnih modelih ishemične kapi. V razmerah in vivo, IGF-1 značilno zmanjša volumen infarkta, v razmerah in vitro preprečuje apoptozo nevronov, ki jo povzročata glutamat in dušikov oksid. Prav tako v razmerah in vitro stimulira proliferacijo in diferenciacijo nevronskih in oligodendrocitnih matičnih celic, kar prispeva k regeneraciji po ishemični poškodbi. IGF-1 stimulira tudi remielinizacijo. Najnovejša raziskava, opravljena v razmerah in vivo na našem oddelku je ponovno odprla vprašanje, ali IGF-1 posreduje nevroprotektivni učinek preko mikroglije. IGF-1 je in vivo značilno znižal izražanje iNOS in IL-1? na nivoju RNA v ishemični hemisferi podgan, in značilno znižal izražanje iNOS v mikrogliji ishemične hemisfere. Na podlagi teh ugotovitev so zaključili, da bi nevroprotektivni učinek lahko temeljil na zniževanju vnetnih mediatorjev v ishemičnih možganih. Multipla skleroza je kronična vnetna avtoimuna bolezen osrednjega živčevja, za katero so značilne vnetne demielizirane lezije in aksonska degeneracija. Etiologija multiple skleroze še ni pojasnjena. V tej magistrski nalogi smo se osredotočili na raziskovanje vpliva pretoka krvi na patogenezo multiple skleroze. Zmanjšan možganski pretok krvi povzroči hipoperfuzijo možganov, kar je lahko povezano s kronično hipoksijo, nastankom fokalnih lezij, degeneracijo aksonov, kognitivno disfunkcijo in možganskim vnetjem. Natančen mehanizem zmanjšanega krvnega pretoka ni znan, možno pa je, da je to posledica visoke ravni možganskega endotelina-1. Reaktivni astrociti naj bi bili odgovorni za povečano izločanje endotelina-1. Bosentan, antagonist receptorja za endotelin, povrne raven perfuzije na raven kotrole. Zmanjšanje endotelina-1 v možganih bi lahko bilo koristno za bolnike z multiplo sklerozo. Namen magistrske naloge je ovrednotiti terapevtsko uporabo inzulinu-podobnega rastnega dejavnika-1 v primeru možganske kapi in učinke modulacije endotelina-1 v primeru multiple skleroze. Za našo raziskavo smo uporabili komercialno dostopno nesmrtno mišjo celično linijo BV2 in humano astrocitno celično linijo 1321N1. Želeli smo ugotoviti, če inzulinu-podoben rastni dejavnik-1 vpliva na izločanje citokinov z neposrednim učinkom na mikroglijo in astrocite med možganskim vnetjem. Poleg tega smo želeli ugotoviti, kakšne neželene učinke bi antagonist receptorja za endotelin-1 imel na možgansko vnetje v primeru multiple skleroze. Merili smo vpliv endotelina na izločanje citokinov iz aktiviranih celic. Celice smo nasadili na ploščo z 12 (1321N1) ali 24 (BV2) vdolbinicami in jih inkubirali čez noč pri 37 ?C, 5 % CO2 in 95 % zraka. V primeru IGF-1 smo jih naslednji dan stimulirali s citokini za 6 ur ali z lipopolisaharidom za 5 ur. Nato smo jim zamenjali raztopine in jih tretirali z IGF-1 5 ali 24 ur. S prenosom po Westernu smo najprej preverili funkcionalnost kinaz Akt in Erk v celicah BV2. V primeru endotelina-1 smo celice najprej inkubirali z endotelinom-1 za 24 ur, nakar smo jih stimulirali s citokini skupaj z endotelinom-1 nadaljnjih 6 ur. Za določanje koncentracije citokinov TNF-?, IL-1? in IL10 v supernatantu smo uporabili encimsko imunoadsorpcijski test (ELISA). Poleg tega smo izmerili izražanje genov za TNF-?, IL-1?, IL10, TGF-? in iNOS na transkripcijski ravni s kvantitativno reakcijo verižnega pomnoževanja s polimerazo v realnem času. Naši rezultati so pokazali funkcionalnost kinaz Erk v celicah BV2 in potrdili delovanje receptorjev IGF-1 na celicah mikroglije. Ugotovili smo, da je IGF-1 po 5-urni inkubaciji značilno povišal raven sproščenega TNF-? v supernatantu celic BV2, ko so bile te stimulirane z lipopolisaridom, in značilno znižal koncentracijo sproščenega TNF-?, ko so bile te stimulirane z interlevkinom-1?. Po 24-urni predtretaciji je endotelin-1 značilno znižal koncentracijo TNF-? v supernatantu z IL-1? stimuliranih celicah BV2. Zaključimo lahko, da IGF-1 učinkuje neposredno na mikroglijo, saj mikroglija izraža aktivne receptorje Erk, katerih aktivacija je ključnega pomena za učinek antiapoptotičnega IGF-1. Ali ima IGF-1 vnetni ali protivnetni učinek na mikroglijo, je odvisno od načina aktivacije. V prihodnje predlagamo, da bi ti eksperimenti bili izvedeni v ishemičnem okolju. Za endotelin-1 predvidevamo, da ima protivnetni vpliv na izločanje TNF-? iz celic aktivirane mikroglije, vendar zaradi visokih vrednosti laktat dehidrogenaze tega še ne moremo potrditi. Če se protivnetni učinek endotelina-1 potrdi, potem bi to lahko pomenilo, da bi uporaba antagonista receptorja za endotelin-1 lahko s povečanim pretokom krvi skozi možgane koristila pacientom z multiplo sklerozo, vendar obenem prispevala k možganskemu vnetju.

• Language: Slovenian
• Keywords: Ključne besede: Inzulinu-podoben rastni dejavnik-1, Endotelin-1, Citokini, Mikroglija, Astrociti
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2019
• PID: 20.500.12556/RUL-108555
• Publication date in RUL: 06.07.2019

Secondary language

• Language: English
• Title: The influence of insulin-like growth factor-1 and endothelin-1 on inflammatory cytokines secretion fom glial cells

Abstract

ABSTRACT Insulin-like growth factor-1 exerts neuroprotective effects in various experimental models of ischemic stroke. Efficient treatments, that would benefit the majority of stroke patients, are lacking. Insulin-like growth factor-1 could be a good treatment option, due to its ability to interfere with many pathways in the ischemic cascade. Endothelin-1, a strong vasoconstrictor, is believed to be released from reactive astrocytes in multiple sclerosis patients and responsible for a reduction in cerebral blood flow, which may contribute to the pathology of multiple sclerosis. The endothelin-1 receptor antagonist bosentan increased the perfusion in the brain, so reduction of endothelin-1 levels in the brain could be beneficial for patients. The purpose of our study was to determine, whether insulin-like growth factor-1 modulates cytokine production by direct effects on microglia or astrocytes during neuroinflammation. Additionally, we wanted to find out, which side effects endothelin receptor antagonists may have on the neuroinflammation, by studying the effect of endothelin-1 on cytokine production. For our research we used the commercially available murine BV2 microglia and 1321N1 human astrocytic cell line. Western blot assays were used to detect functional IGF-1 receptors by assessing the phosphorylation of Akt and Erk kinases. The cells were exposed to a pro-inflammatory stimulus and treated with insulin-like growth factor-1, or they were pre-treated with endothelin-1, and later exposed to a pro-inflammatory stimulus. Cytokines released in the supernatant were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the effects on the mRNA levels were assessed with real time quantitative polymerase chain reaction. Microglial BV2 cells express functional IGF-1 receptors signaling through the MAPK-pathway. After 5-hour incubation time with BV2 cells, insulin-like growth factor-1 significantly increased TNF-? production, when exposed to lipopolysaccharide, and significantly reduced TNF-? release, when exposed to interleukin-1?. After 24 h of pre-incubation with endothelin-1, BV2 cells secreted significantly less TNF-? in response to interleukin-1?. We conclude, that insulin-like growth factor-1 modulates cytokine production and its pro- or anti-inflammatory effects depend on the type of stimulation. Therefore, additional studies should be done preferably in ischemic environment. Our results conclude, that endothelin-1 shows anti-inflammatory effect on neuroinflammation, but its cytotoxicity remains to be determined.

• Keywords: KEY WORDS: Insulin-like growth factor-1, Endothelin-1, Cytokines, Microglia, Astrocytes