Pri magistrski nalogi sem se ukvarjala z izdelavo polimernih nanodelcev za potencialno uporabo v ustni votlini za zdravljenje kserostomije. Občutek suhih ust oz. kserostomija je pogosto povezana s povečanim tveganjem za ustne bolezni zaradi zmanjšanega ali povsem odsotnega izločanja sline in negativno vpliva na življenje pacientov. Vzroki za pojav kserostomije so lahko jemanje nekaterih zdravil, na primer antiholinergikov, Sjögrenov sindrom (kronična avtoimuna vnetna bolezen s progresivno limfocitno infiltracijo žlez slinavk in solznih žlez), ionizacijsko sevanje pri bolnikih z rakom v predelu glave in vratu ali bolezni vezivnega tkiva. Slina ima v ustih pomembno vlogo pri procesiranju in požiranju hrane, čiščenju ustne votline, vzdrževanju nevtralnega pH in preprečevanju demineralizacije zob. Proteini, ki se nahajajo v slini, vlažijo in pokrivajo ustna tkiva in varujejo ustno sluznico pred kemijskimi, mikrobiološkimi in fizičnimi poškodbami. Pacienti s kserostomijo imajo posledično težave pri požiranju suhe hrane in govorjenju, spremenjen okus, povečan vnos tekočine in neprijeten občutek v ustih ponoči. Pojavijo se lahko razpokane ustnice in jezik, razpoke v ustnih kotičkih, povečan dentalni karies, erozija zob, otekanje žlez slinavk, mukozitis (vnetje sluznice v ustni votlini), ustna kandidaza in razjede. Pacientom so na voljo različni pripravki za zdravljenje kserostomije: 1) zdravila, ki stimulirajo izločanje sline (npr. pilokarpin) 2) nadomestki sline (ustna voda, pastile, spreji, geli, žvečilni gumiji). Slednji imajo zaradi dinamične narave ustne votline in morda tudi zaradi odsotnosti mukoadhezivnih lastnosti kratek čas zadrževanja na ustni sluznici in tako zagotavljajo le začasno lajšanje simptomov kserostomije. Glavna prednost polimernih nanodelcev pri zdravljenju simptomov kserostomije je podaljšan čas zadrževanja na ustni sluznici zaradi interakcije z mucinom, kar lahko zmanjša pogostost odmerjanja in poveča sodelovanje bolnikov pri zdravljenju poleg tega pa s prekrivanjem površine ustne sluznice ustvarjajo tudi fizično zaščito. Polimerni nanodelci se lahko vgradijo v običajne farmacevtske oblike kot sta na primer ustna voda ali sprej.
Namen magistrske naloge je razdeljen na tri dele: 1) pripraviti stabilne polimerne nanodelce, 2) raziskati interakcije med nanodelci in mucinom z reološko metodo in 3) spreminjati viskoznost disperzije polimernih nanodelcev z nevtralnim polimerom (hidroksietilceluloza) z namenom doseganja viskoznosti disperzije nanodelcev, podobni človeški slini.
Za pripravo nanodelcev smo uporabili polisaharide naravnega izvora, sestavljene iz monosaharidnih enot, ki so med seboj povezane z glikozidnimi vezmi. Polimera alginat in LM-pektin sta pri fizioloških pogojih negativno nabita, hitosan pa je polikation. So stabilni, netoksični, hidrofilni, mukoadhezivni in biorazgradljivi ter zato primerni za pripravo nanodelcev. Pripravili smo jih z metodo ionskega premreževanja. V raztopino polimera (alginat, pektin ali hitosan) v 0,05 M NaCl smo enakomerno kapljali raztopino premreževala (cinkov klorid ali tripolifosfat). Spreminjali smo masno razmerje premreževal in polimera ter koncentracijo polimera. Nanodelcem smo nato en dan po pripravi vrednotili velikost, polidisperzni indeks, zeta potencial in motnost. Spremljali smo tudi stabilnost nanodelcev skozi čas. Pojav agregatov je bil vizualni znak za nestabilnost vzorca. Da so nanodelci primerni, morajo ustrezati kriteriju, ki je bil postavljen: velikost nanodelcev mora biti med 100 in 500 nm; polidisperzni indeks mora biti manjši od 0,3; absolutna vrednost zeta potenciala mora biti večja od 30 mV; v vzorcih ne sme biti opaznih agregatov (motnost mora biti blizu 0 cm-1). Najprej smo pripravili nanodelce s koncentracijo polimera 0,05 % w/w, z različnimi masnimi razmerji premreževal in polimera. Za najboljše formulacije nanodelcev so se izkazale naslednje: a) nanodelci iz alginata (0,05 % w/w), z razmerjem ZnCl2 : alginat = 35:65; b) nanodelci iz hitosana (0,05% w/w), z razmerjem TPP : hitosan = 15:85 ali 20:80. Nanodelci iz alginata in hitosana so ostali stabilni en mesec, medtem ko je velikost nanodelcev iz LM-pektina že po dveh tednih narasla preko 700 nm.
Interakcijo med nanodelci in mucinom smo ovrednotili z reološkim sinergizmom. V literaturi so poročali o študijah, kjer so z reološkimi metodami določali interakcijo med različnimi polimeri in mucinom, vendar pristop ni bil standardiziran, zato je rezultate različnih študij težko primerjati med seboj. Študij, kjer bi z reološkimi metodami vrednotili interakcijo med nanodelci in mucinom, v literaturi ni. Reološki sinergizem izračunamo s formulo ?? = ?mix - (?m+ ?p), kjer je ?? reološki sinergizem, ?mix je viskoznost raztopine polimera (oz. nanodelcev) in mucina, ?m je viskoznost raztopine mucina in ?p viskoznost raztopine polimera (oz. nanodelcev). Viskoznosti ?mix, ?m and ?p morajo biti izmerjene pri enakih pogojih (koncentracija mucina in polimera oz. nanodelcev, temperatura, strižna hitrost). Metoda lahko razlikuje med pozitivnim in negativnim sinergizmom, ali pa je sinergizem 0, kar pomeni, da v sistemu ni interakcije. Za določitev parametrov metode (koncentracije polimera in mucina, topilo, strižna hitrost), smo najprej izmerili viskoznost raztopin z različnimi koncentracijami alginata v 5 mM fosfatnem pufru in 0,05 M NaCl. Rezultati pri strižni hitrosti med 0,1 in 10,0 1/s niso bili ponovljivi (intervali napak so bili zelo veliki), zato smo se odločili, da bomo viskoznost merili pri strižni hitrosti med 10 in 100 1/s. Izmerili smo tudi viskoznost raztopin mucina z različnimi koncentracijami v 5 mM fosfatnem pufru, 0,05 M NaCl in »kombiniranem« topilu z razmerjem 5 mM fosfatni pufer : 0,05 M NaCl = 1:1 pri strižni hitrosti 10 – 100 1/s. Glede na rezultate smo za nadaljnje reološke eksperimente izbrali koncentracijo polimera 0,5% w/w v 0,05 M NaCl, koncentracija mucina v kombiniranem topilu pa je bila 0,25% w/w. Najprej smo izračunali reološki sinergizem za interakcijo med različnimi polimeri (alginat, LM-pektin, hitosan) in mucinom. Raztopina hitosana je po dodatku mucina postala motna. Ob tem smo izračunali negativen reološki sinergizem (-0,0028 Pas). Oboje, vizualna sprememba in negativen reološki sinergizem, nakazujeta na interakcijo med hitosanom in mucinom. Vrednosti reološkega sinergizma za vzorca, ki sta vsebovala alginat oz. LM-pektin in mucin sta bili blizu vrednosti 0 Pas. Interakcije v tem primeru nismo dokazali.
Koncentracija pripravljenih nanodelcev v raztopini (0,05% w/w) je bila za merjenje viskoznosti prenizka, saj je bil mucin s koncentracijo 0,25% w/w v presežku, poleg tega pa se je že tako nizka koncentracija po dodatku raztopine mucina še zmanjšala. Pripravili smo nanodelce z višjo koncentracijo (0,07% w/w) in jih še dodatno skoncentrirali z uporabo ravnotežne dialize. Nanodelce iz hitosana in alginata smo uspešno skoncentrirali. Izračunan reološki sinergizem je bil v obeh primerih negativen (-0,0009 Pas pri nanodelcih iz hitosana in -0,0004 Pas pri alginatnih nanodelcih), kar nakazuje na potencialno interakcijo med nanodelci in mucinom. Poleg tega smo pri nanodelcih iz hitosana s prostim očesom opazili tudi agregacijo na dnu viale, kar lahko potrdi interakcijo. Pri koncentriranju nanodelcev iz LM-pektina je med dializo prišlo do agregacije nanodelcev, zato rezultati reološkega sinergizma za interakcijo nanodelcev iz LM-pektina z mucinom niso uporabni.
Najboljšim formulacijam nanodelcev iz hitosana, alginata in LM-pektina s koncentracijo 0,05% w/w smo izmerili viskoznost, ki je bila v območju 0,8 – 0,9 mPas. Cilj je bil pripraviti stabilno disperzijo nanodelcev z viskoznostjo, podobno viskoznosti človeške sline (2 – 10 mPas). Izmerili smo viskoznost raztopin hidroksietilceluloze s tremi različnimi koncentracijami (0,5% w/w, 1,0% w/w in 1,5% w/w) pri strižni hitrosti 0,1 – 100 1/s. Pred dodatkom raztopine hidroksietilceluloze je bilo nanodelce potrebno skoncentrirati. Končna koncentracija nanodelcev v raztopini je bila 0,05% w/w, hidroksietilceluloze pa 0,5% w/w, 1,0% w/w ali 1,5% w/w. Končna viskoznost disperzij nanodelcev iz hitosana in alginata po dodatku hidroksietilceluloze (1% w/w ali 1,5% w/w) je bila v območju 2 mPas do 5 mPas, kar nakazuje na uspešno spreminjanje viskoznosti disperzije nanodelcev in doseganje viskoznosti, podobni človeški slini. Pri koncentriranju nanodelcev iz LM-pektina je prišlo do agregacije nanodelcev, zato rezultati viskoznosti raztopine po dodatku hidroksietilceluloze niso bili uporabni. Za primerjavo smo izmerili tudi viskoznost produkta Biot?ne®, ki prav tako vsebuje hidroksietilcelulozo in se uporablja kot nadomestek sline. Viskoznost produkta Biot?ne® je bila 10 mPas in konstantna v celotnem območju merjenja, kar je v nasprotju z viskoznostjo disperzij nanodelcev, kjer se je viskoznost z naraščajočo strižno hitrostjo zmanjševala.
|
