Verifikacija metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti za določanje fenilalanina in tirozina : magistrski študij Laboratorijska biomedicina

Škafar, Nives (author), Trebušak Podkrajšek, Katarina (mentor), Šmon, Andraž (co-mentor)

Fenilketonurija velja za prvo raziskano prirojeno presnovno bolezen in hkrati tudi za najpogostejšo v skupini presnovnih motenj aminokislin. Bolezenska sprememba v genu za encim fenilalanin hidroksilazo onemogoči njegovo normalno delovanje, zato je motena presnova aminokisline fenilalanina v tirozin. Količina fenilalanina v plazmi se poveča in povzroči nepopravljivo poškodbo možganov, kar se kaže v obliki hudih nevroloških okvar. Fenilketonurija je neozdravljiva bolezen, vendar z pravočasno uvedeno in ustrezno prilagojeno dieto in spremljanjem fenilalanina in tirozina v plazmi, lahko preprečimo razvoj kliničnih znakov. Za pravočasno prepoznavanje bolezni se izvaja presejalno testiranje novorojencev, ki je organizirano v razvitih državah, tudi v Sloveniji. Že leta 1960 so za namen diagnoze uporabljali Guthriejev test, sedaj se uporabljajo izboljšane in zmogljivejše analizne tehnike, ki omogočajo zanesljivejše rezultate. V magistrskem delu smo primerjali in ovrednotili lastnosti metod, ki se uporabljajo za potrditev diagnoze in spremljanje uspešnosti zdravljenja bolnikov. V Laboratoriju za presnovne motnje, Službe za specialno diagnostiko Pediatrične klinike kot potrditveno metodo uporabljajo tandemsko masno spektrometrijo ((HP)LC-MS/MS). Zaradi želje po hitrejši in enostavnejši analizi vzorcev smo želeli omenjeno metodo nadomestiti s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z UV detektorjem (HPLC-UV). Z obema metodama smo analizirali 114 naključno izbranih vzorcev plazme, v katerih smo določali koncentracijo fenilalanina in tirozina. Rezultate obeh analiznih metod smo primerjali z Bland-Altmanovim diagramom razlik in določili stopnjo ujemanja. Ujemanje metod smo preverili tudi s določitvijo linearne povezanosti s pomočjo Spearmanovega korelacijskega koeficienta. Izpostavili smo prednosti in slabosti obeh primerjalnih metod. Ustreznost metode HPLC-UV za uporabo v klinični diagnostiki smo preverili z verifikacijo, kjer smo ovrednotili parametra ponovljivost in odklon od prave vrednosti. Zanesljivost merjenja vzorcev z HPLC-UV metodo smo tekom analize preverjali z določanjem natančnosti in točnosti kontrolnih materialov. Prednost HPLC-UV metode pred metodo HPLC-MS/MS je v hitrejši in enostavnejši pripravi vzorcev. Za analizo je potrebna manjša količina vzorca, krajši je tudi čas analize. Postavitev metode za detekcijo omenjenih aminokislin je enostavnejša kot pri HPLC-MS/MS, zaradi izokratskega spiranja je potrebna le ena vrsta mobilne faze, poleg tega je pri metodi HPLC- VI UV hitrejša in enostavnejša obdelava podatkov. Navsezadnje je manjša tudi cena analize. Z izvedbo verifikacije smo ugotovili, da metoda HPLC-UV določa koncentracije fenilalanina in tirozina v skladu z zahtevami (< 15 %), prav tako rezultati ponovljivosti (Phe 4,6 % 11,8 %, Tyr 2,3 % 11,3 %) in točnosti (Phe 12,2 %, Tyr 10,5 % 13,5 %) kontrolnega materiala izmerjeni tekom analize vzorcev, kažejo na ustrezno zanesljivost rezultatov in ne presegajo postavljene meje sprejemljivosti (15 %). Z Bland-Altmanovim diagramom razlik smo ugotovili, da obstajajo pomembne razlike med rezultati obeh metod in da z metodo HPLC-UV dobimo višje vrednosti fenilalanina, tirozina in njunega razmerja. Vrednosti fenilalanina, izmerjene z metodo HPLC-UV, so višje v povprečju za 24,5 %, vrednosti tirozina za 23,9 % in vrednosti razmerja Phe/Tyr so višje povprečno za 0,69 %. Na podlagi korelacijskega koeficienta, ki je večji od 0,80 pri meritvah fenilalanina, tirozina in njunega razmerja je linearna povezanost med metodama visoka. Zaključimo lahko, da ima metoda HPLC-UV številne prednosti in pozitivne lastnosti. Ugotovili smo, da metoda meri v skladu z zahtevami in da so rezultati meritev notranje kontrole dovolj zanesljivi za namen potrditve diagnoze in vodenja zdravljenja fenilketonurije. V nasprotju z omenjenim, smo z Bland-Altmanovo oceno ujemanja ugotovili, da razlike med rezultati presegajo dopustno mejo. Zaključimo lahko, da bi za ustrezno zamenjavo nove metode HPLC-UV s staro, morali prirediti referenčne vrednosti za fenilalanin in tirozin, ki bi ustrezale kriterijem metode HPLC-UV..

• Language: Slovenian
• Keywords: presnovne motnje, fenilketonurija, fenilalanin, tirozin, metoda HPLC-UV, metoda HPLC-MS/MS
• Work type: Master's thesis/paper
• Typology: 2.09 - Master's Thesis
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Place of publishing: Ljubljana
• Publisher: [N. Škafar]
• Year: 2019
• Number of pages: X, 58 f.
• PID: 20.500.12556/RUL-106093
• UDC: 543.544.5:616-008.9(043.3)
• COBISS.SI-ID: 4665969
• Publication date in RUL: 25.01.2019

Secondary language

• Language: English
• Title: Verification of a high performance liquid chromatography method for phenylalanine and tyrosine determination