20.500.12556/RUL-187676 Identifikacija hidrolaz gostiteljskih celic in optimizacija njihovega odstranjevanja v proizvodnji terapevtskih protiteles Identification of host cell hydrolases and optimisation of their removal during therapeutic antibody production Terapevtska monoklonska protitelesa (mAb) predstavljajo večino bioloških učinkovin. Praviloma jih pridobivamo s tehnologijo rekombinantne DNA z izražanjem v celicah ovarija kitajskega hrčka. Osrednjo skupino procesnih nečistot predstavljajo proteini, ki jih sproščajo gostiteljske celice (t.i. proteini gostiteljskih celic; angl. host cell proteins, HCP). Mednje sodijo tudi hidrolaze, ki lahko razgrajujejo pomožne snovi, kot so polisorbati, kar zmanjšuje stabilnost formulacije, skrajšuje rok uporabnosti izdelka in ogroža njegovo kakovost ter varnost. To doktorsko delo odpravlja vrzeli pri zaznavanju in odstranjevanju nizko zastopanih encimsko aktivnih HCP z na aktivnosti osredotočenim pristopom, ki povezuje profiliranje proteinov na osnovi aktivnosti, preučevanje interakcij HCP–mAb, tarčno proteomiko, encimske teste in racionalno zasnovo procesov izolacije in čiščenja učinkovine. Pokazali smo, da encimsko katalizirano razgradnjo polisorbatov v formulaciji mAb lahko pripišemo specifičnim hidrolazam iz skupine HCP. S pomočjo z biotinom označene sonde, ki je vsebovala reaktivno fluorofosfonatno skupino, in masne spektrometrije smo identificirali acil‑protein tioesterazo 1 (APT1) kot nov HCP, sposoben razgradnje polisorbatov. Na vpletenost APT1 v hidrolizo polisorbatov nakazuje več dokazov: (i) korelacija med ravnjo APT1 in hitrostjo razgradnje polisorbata v formulaciji mAb, (ii) ujemanje razgradnega profila polisorbata s tistim, ki smo ga zaznali za rekombinantni encim APT1, in (iii) zaščita pred razgradnjo polisorbatov ob dodatku selektivnih zaviralcev APT1 ML348 in ML211. Na primeru APT1 smo pokazali, da lahko zadrževanje kritičnih HCP izvira iz specifičnih asociacij med njimi in mAb. Med kromatografijo z ločevanjem po velikosti se APT1 eluira sočasno z monomerno frakcijo mAb, medtem ko smo z bioslojno interferometrijo potrdili specifično interakcijo APT1 s prvo konstantno domeno težke verige (CH1) protitelesa. Pokazali smo tudi, da lahko z uvedbo alternativnih kromatografskih tehnik in optimizacijo kromatografskih pogojev izboljšamo odstranjevanje produktu škodljivih HCP. V pretočnem načinu anionske izmenjevalne kromatografije sta membranska adsorberja izkazala učinkovitejše odstranjevanje vseh HCP v primerjavi z delčnim nosilcem. Pokazali smo, da pH in prevodnost tekočine nanosa ter količina nanosa mAb na kromatografski nosilec močno vplivajo na odstranjevanje hidrolaz. Ugotovili smo, da celokupna količina HCP ni nujno povezana s tveganjem za razgradnjo polisorbata in da funkcijsko usmerjeni testi pomagajo prednostno izbrati pogoje, ki smiselno zmanjšujejo encimsko aktivnost. Opisani poteki dela so široko uporabni pri zasnovi procesov izolacije in čiščenja, ki ciljajo na učinkovito odstranjevanje encimsko aktivnih HCP, in tako podpirajo proizvodnjo stabilnih, visokokakovostnih in varnih bioloških zdravil. Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) represent a majority of biopharmaceuticals and are primarily recombinantly expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. A major class of process-related impurities are the host cell proteins (HCPs) released from the producing cell line. Among these, certain hydrolases can degrade excipients such as polysorbates, causing formulation instability, shortening product’s shelf life, and threatening its quality and safety. This doctoral work addresses gaps in detecting and mitigating low-abundance enzymatically active HCPs through an activity-centric framework that integrates activity-based protein profiling, HCP–mAb interaction screening, targeted proteomics, enzyme assays, and rational downstream process design. First, we show that the enzyme-driven polysorbate degradation in a mAb formulation can be attributed to specific enzymatically active HCPs enriched by covalent activity-based probes. Using the fluorophosphonate-biotin probe and mass spectrometry, we identified acyl-protein thioesterase-1 (APT1) as a previously unreported polysorbate-degrading HCP. Several lines of evidence confirm that APT1 is indeed responsible for polysorbate hydrolysis: the correlation between APT1 abundance and polysorbate loss, replication of the monoester-selective degradation fingerprint with recombinant APT1, and prevention of polysorbate degradation using selective APT1 inhibitors ML348 and ML211. Second, we find that persistence of critical HCPs can arise from specific HCP–mAb associations. APT1 exhibits product-dependent hitchhiking, co-eluting with the monomeric mAb fraction during preparative size-exclusion chromatography and binding the mAb’s CH1 region as determined by the biolayer interferometry. Third, we demonstrate that implementing alternative chromatographic techniques and optimizing chromatographic conditions can reduce critical (product-detrimental) HCPs. In a flow-through anion-exchange case study, membrane adsorbers outperformed bead resin for total HCP clearance. Additionally, factors such as feed pH, feed conductivity, and loading density had a significant impact on esterase clearance. We further show that total HCP abundance does not necessarily correlate with polysorbate-degrading risk, and that function-focused readouts better prioritize conditions that meaningfully reduce hydrolase activity. The workflows outlined here are broadly applicable to downstream process designs targeting effective enzymatic HCPs removal, ultimately supporting the production of stable, high-quality, and safe biopharmaceutical products. proteini gostiteljskih celic hidrolaze monoklonska protitelesa polisorbati acil-protein tioesteraza 1 profiliranje proteinov na osnovi aktivnosti masna spektrometrija zaključni procesi host cell proteins hydrolases monoclonal antibodies polysorbates acyl-protein thioesterase-1 activity-based protein profiling mass spectrometry downstream processing true false false [E. Šprager] Slovenski jezik Angleški jezik Doktorska disertacija 2026-09-13 07:15:20 2026-09-13 07:15:43 2026-09-21 14:46:17 0000-00-00 00:00:00 2026 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 1970-01-01 615.35(043.3) 41065 291368963 10349.pdf 10349.pdf 1 C5065B5E180BBD84B48030A92B77739A f1edf28a0380236d35f9bd0eb90551335472a4d819e98ea9814ce86abeadb9f2 2fdc829b-af32-11f1-8bc5-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=247379 Fakulteta za farmacijo 0 0 0