20.500.12556/RUL-186539 Primerjava protokolov za imunofluorescenčno detekcijo cirkulirajočih tumorskih celic raka dojke Comparison of immunofluorescence staining protocols for detecting breast cancer circulating tumor cells CTC predstavljajo pomemben biološki označevalec in omogočajo vpogled v razvoj in napredovanje bolezni. Na Onkološkem inštitutu Ljubljana smo vzpostavili metodo za izolacijo CTC iz vzorca krvi. Po izolaciji smo pripravili citološke preparate, ki smo jih nato opredelili s citopatološko analizo. Delali smo na vzorcih 10 bolnic, poprečne mediane starosti 53 let, odvzetih v klinični raziskavi GALIA. Imunofluorescenčno (IF) barvanje nam omogoča, da na istem vzorcu naenkrat označimo in opredelimo več različnih celičnih označevalcev. Zato smo razvili hišni protokol, pri katerem označujemo 4 celične označevalce. Za barvanje IF smo uporabili metanolno fiksirane preparate. Vzpostavljeni protokol pa se na vzorcih CTC, pridobljenih iz krvi bolnic z rakom dojk ni vedno izkazal za optimalnega. Predvsem smo zaznali bleda jedra in neenotno označevanje CD45. V nekaterih primerih je tudi pokazal odsotnost krvnih označevalcev, kot tudi odsotnost trombocitov. Zaradi tega smo primerjali vzpostavljeni hišni IF protokol s protokolom Portrait®+ (Portrait®+ CTC Staining Kit, CelLBxHealth plc.), ki je bil razvit in validiran za označevanje CTC. Protokol Portrait®+ vsebuje večji nabor celičnih označevalcev, kar pa je poslovna skrivnost. Pri protokolu Portrait®+ smo uporabili dve vrsti kontrolnih preparatov: enega fiksiranega v metanolu, drugega pa v acetonu. Na koncu smo slikanje izvedli s fluorescenčnim mikroskopom Zeiss Axio Observer; prikaze fluorescenčnih slik celic smo pripravili s programsko opremo Imaris. Za statistično analizo in risanje grafov smo uporabili programsko opremo GraphPad Prism, verzija 10.6.1. Pri metanolu smo opazili večjo degeneracijo celic in večji vpliv na morfologijo. Protokol Portrait®+ je imel več krvnih markerjev; bilo je prisotnega več rdečega obarvanja, ki bi ga lahko zamenjali za eritrocite, vendar v kitu ni protiteles za eritrocite. V vzorcih, pobarvanih s protokolom Portrait®+, smo določili večje število CTC in skupkov CTC kot pri barvanju s hišnim protokolom. CTC represent an important biological marker, and provide insight into the development and progression of the disease. At the Ljubljana Oncology Institute, we have established a method for isolating CTCs from a blood sample. After isolation, we prepared cytological preparations, which we then identified with cytopathological analysis. We worked on the samples of 10 patients, median age 53 taken in the GALIA clinical survey. Immunofluorescence (IF) staining allows us to mark and identify several different cell markers at once on the same sample. For this purpose, we have developed an in-house protocol in which we label 4 cell markers. We used methanol-fixed preparations for IF staining. The established protocol on CTC samples obtained from the blood of breast cancer hospitals has not always proven to be optimal. In particular, we noticed pale nuclei and uneven labeling of CD45. It also showed in some cases the absence of blood markers, nor did it show thrombocytopenia. For this reason, we compared the established in-house IF protocol with the Portrait®+ protocol (Portrait®+ CTC Staining Kit, CelLBxHealth plc.), which was developed and validated for CTC labeling. The Portrait®+ protocol contains a larger set of cell markers, which is a trade secret. For Portrait®+, we used two types of control preparations: one fixed in methanol, the other in acetone. Finally, we performed the imaging with a Zeiss Axio Observer fluorescence microscope and created images using the Imaris software and GraphPad Prism software version 10.6.1. For statistical analysis and graph drawing. With methanol, we observed a greater degeneration of cells and a greater impact on morphology. Portrait®+ had more blood markers, but more red staining was present, which could be mistaken for erythrocytes, but there were no antibodies for erythrocytes. In the samples stained with the Portrait®+ protocol, we determined a higher number of single CTCs in the pool of CTC clusters than when stained with the in-house protocol. CTC IF markerji zgodnji rak dojk hišni protokol Giemsa Portrait®+ CTC IF markers early breast cancer In-house protocol Giemsa Portrait®+ true false false [F. E. Krekić] Slovenski jezik Angleški jezik Magistrsko delo/naloga 2026-09-03 07:16:50 2026-09-03 07:17:00 2026-09-04 04:30:38 0000-00-00 00:00:00 2026 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 1970-01-01 618.19-006:616-07(043.2) 286702 289885187 60392.pdf 60392.pdf 1 F6FE7684EC19A002A59B7309B8696606 98bba1eb8a060e43ffc976ab4afc528a143218f3aab5da4bd21675f4c8ef58be 4b87667e-a756-11f1-9b0d-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=245811 Biotehniška fakulteta 0 0 0