20.500.12556/RUL-184196 Vzpostavitev bakterijskega sistema LexKan za selekcijo afiteles, ki inhibirajo tvorbo homodimerov proteaze M$^{pro}$ iz SARS‑CoV‑2 Development of the LexKan bacterial system for the selection of affibodies that inhibit homodimer formation of the M$^{pro}$ protease from SARS-CoV-2 Pandemija COVID-19 je izpostavila nujnost razvoja novih terapevtskih strategij proti virusnim okužbam, zlasti v primerih, ko klasična protivirusna zdravila niso učinkovita. Glavna proteaza SARS-CoV-2 (M$^{pro}$) je uveljavljena terapevtska tarča, saj je bistvena za proteolitično procesiranje virusnih poliproteinov, potrebnih za replikacijo virusa. Njena katalitična aktivnost je strogo odvisna od homodimerizacije, zato dimerizacijska površina predstavlja zanimivo alternativno mesto za inhibicijo. V magistrskem delu smo vzpostavili in validirali nov bakterijski selekcijski sistem LexKan, ki omogoča fenotipsko selekcijo afiteles na podlagi preživetja celic E. coli v prisotnosti kanamicina. Z uporabo kontrolnih proteinov smo optimizirali selekcijske pogoje in potrdili delovanje sistema tako v tekočem kot na trdnem gojišču. Pripravili smo knjižnico afiteles z naključno mutagenezo 13 površinsko izpostavljenih aminokislin ter izvedli selekcijo kandidatov za inhibitorje dimerizacije M$^{pro}$. Izbranih šest afiteles in en afipeptid smo uspešno izrazili, izolirali in okarakterizirali. Eksperimentalna analiza z velikostno izključitveno kromatografijo in masno fotometrijo je pokazala, da je M$^{pro}$ pri nižjih koncentracijah pretežno prisotna kot homodimer, pri višjih koncentracijah pa tvori tudi višje oligomerne oblike. Prisotnost afitelesa 4 je povzročila koncentracijsko odvisno zmanjšanje deleža dimera, kar kaže na delno destabilizacijo homodimerizacije. Nadaljnja bioinformatska analiza z orodji AlphaFold, PDBePISA in HADDOCK je pokazala, da se afitelo 4 najverjetneje veže na dimerizacijsko površino M$^{pro}$ ter med vsemi analiziranimi kandidati izkazuje najugodnejše interakcije. Rezultati kažejo, da afitelo 4 predstavlja obetavnega kandidata za nadaljnjo optimizacijo kot potencialni inhibitor proteaze M$^{pro}$ in posledično replikacije SARS-CoV-2. The COVID-19 pandemic highlighted the urgent need for novel therapeutic strategies against viral infections, particularly in cases where conventional antiviral drugs are ineffective. The main protease of SARS-CoV-2 (M$^{pro}$) is a well-established therapeutic target, as it is essential for the proteolytic processing of viral polyproteins required for viral replication. Its catalytic activity is strictly dependent on homodimerisation, making the dimerisation interface an attractive alternative target for inhibition. In this master’s thesis, we established and validated a novel bacterial selection system, LexKan, which enables the phenotypic selection of affibodies based on the survival of E. coli cells in the presence of kanamycin. Using control proteins, we optimised the selection conditions and confirmed the functionality of the system in both liquid and solid media. A library of affibodies was generated by random mutagenesis of 13 surface-exposed amino acid residues, followed by the selection of candidates capable of inhibiting Mpro dimerisation. Six affibodies and one affipeptide were successfully expressed, purified, and characterised. Experimental characterisation by size-exclusion chromatography and mass photometry demonstrated that M$^{pro}$ exists predominantly as a homodimer at lower concentrations, while higher-order oligomeric species are formed at elevated concentrations. The presence of affibody 4 resulted in a concentration-dependent decrease in the dimeric fraction, indicating partial destabilisation of homodimerisation. Subsequent bioinformatic analysis using AlphaFold, PDBePISA, and HADDOCK suggested that affibody 4 most likely binds to the M$^{pro}$ dimerisation interface and exhibits the most favourable interactions among the analysed candidates. These results indicate that affibody 4 represents a promising candidate for further optimisation as a potential inhibitor of M$^{pro}$ and, consequently, SARS-CoV-2 replication. afitelo bakterijski sistem LexKan proteaza Mpro SARS-CoV-2 affibody LexKan bacterial system Mpro protease SARS-CoV-2 true false false Slovenski jezik Angleški jezik Magistrsko delo/naloga 2026-07-01 13:00:04 2026-07-01 13:00:21 2026-07-31 10:06:04 0000-00-00 00:00:00 2026 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 25488 286552067 Kogovsek_Jan_-_Vzpostavitev_bakterijskega_sistema_LexKan_za_selekcijo_afiteles,_ki_inhibirajo_tv.pdf Kogovsek_Jan_-_Vzpostavitev_bakterijskega_sistema_LexKan_za_selekcijo_afiteles,_ki_inhibirajo_tv.pdf 1 969CCCE85BF349BC9A61903264155E59 39a6042c1d5ecaf1dfb466dc69019c55c7dc9daaf484ab8c8f3d05aff6406414 f4e9960d-753b-11f1-9b0d-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=236793 Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 0 0 0