20.500.12556/RUL-172546 Priprava in izražanje mutantov človeškega α-aktinina-1 Cloning and expression of human α-actinin-1 mutants Citoskelet deluje kot osrednja znotrajcelična struktura organizmov. Sestavljen je iz aktinskih filamentov, mikrotubulov in intermediarnih filamentov, sodelujejo pa tudi številni drugi proteini. Med proteini, ki so pomembni za organizacijo aktinskih filamentov, so α-aktinini, ki tvorijo homodimere, sestavljene iz aktin vezavne domene, vratu, paličaste domene v obliki spektrinskih ponovitev in kalmodulinu podobne domene, ki pri nekaterih izooblikah veže kalcijeve ione. α-aktinin-1 je eden najpomembnejših prečnih povezovalcev aktina v fokalnih stikih in stresnih vlaknih; njegova aktivnost naj bi bila regulirana s kalcijem. Podrobnosti konformacijskih sprememb ob vezavi kalcijevega iona so še predmet raziskav, nedavno pa je bil odkrit model regulacije α-aktinina-1 s kalcijevimi ioni [22]. Ob vezavi Ca$^{2+}$ naj bi se α-aktinin-1 postavil v bolj zaprto konformacijo, s čimer se spremeni način povezovanja aktinskih filamentov. Za namen analize konformacijskih sprememb ob vezavi kalcija in vpliva α-aktinina-1 k prečnemu povezovanju aktinskih filamentov smo pripravili in izrazili osem mutantov: štiri polovičnega dimera in štiri divjega tipa proteina. Osredotočili smo se predvsem na interakcije med domeno EF12 z vezanim kalcijevim ionom in paličasto domeno, ki bi jih mutacije povzročile. Trije mutanti divjega tipa proteina so vsebovali enojno mutacijo, ena pa dvojno; enako velja za mutante polovičnega dimera (verigi A in B), ki vsebuje vse funkcionalne domene kot popolen protein divjega tipa α-aktinina-1. Izvajali smo mestnospecifično mutagenezo z reakcijo PCR, ki je bila za vse konstrukte uspešna. Mutante smo nato izrazili v gostiteljskem sevu E. coli Bl21[DE3]pLysS, s čimer smo potrdili, da je ta bakterijski sev ustrezen za izražanje teh mutantov. Na koncu smo izvedli NaDS-PAGE, da smo preverili količino produkta v topni frakciji in dokazali, da se mutanti α-aktinina-1 pretežno izražajo v topni obliki. The cytoskeleton functions as the central intracellular structure of organisms. It is composed of actin filaments, microtubules, and intermediate filaments, and many other proteins. Among the proteins that organize actin filaments are α-actinins, which form homodimers consisting of an actin-binding domain, a neck, a rod-shaped domain in the form of spectrin repeats, and a calmodulin-like domain that binds calcium ions. α-actinin-1 is one of the most important cross-linkers of actin in focal junctions and stress fibers, and its activity is thought to be regulated by calcium. The exact conformational changes upon calcium ion binding are still the subject of research, but a model of regulation of α-actinin-1 by calcium ions has recently been discovered. Upon Ca$^{2+}$ binding, α-actinin-1 is thought to be placed in a more closed conformation, thereby changing the way actin filaments are linked. To analyze the conformational changes upon calcium binding and the influence of α-actinin-1 on actin filament crosslinking, we prepared and expressed eight mutants, including four half-dimers and four wild-type proteins. We focused primarily on the interactions between the EF12 domain (with the calcium ion bound) and the rod domain that the mutations would cause. Three mutants of the wild-type protein contained a single mutation, one a double mutation; the same applies to mutants of the half-dimer (chains A and B), which contains all the functional domains of the complete wild-type α-actinin-1 protein.We performed site-specific mutagenesis by PCR, which was successful for all constructs. The mutants were then expressed in the host strain E. coli Bl21[DE3]pLysS, confirming that this bacterial strain is suitable for the expression of these mutants. Finally, we performed NaDS-PAGE to verify the amount of product in the soluble fraction and demonstrated that the α-actinin-1 mutants are predominantly expressed in the soluble form. aktin α-aktinin-1 kalcij konformacijske spremembe actin α-actinin-1 calcium conformational changes true false false Slovenski jezik Angleški jezik Diplomsko delo/naloga 2025-09-08 12:55:00 2025-09-08 12:55:07 2025-10-29 13:02:35 0000-00-00 00:00:00 2025 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 25398 255244803 Pojbic_Taja_-_Priprava_in_izrazanje_mutantov_cloveskega_α-aktinina-1.pdf Pojbic_Taja_-_Priprava_in_izrazanje_mutantov_cloveskega_α-aktinina-1.pdf 1 A0C06EF0CA8BEDCC95158D973DDFB2B1 e3fe84dce63a72f54f951168fd48f263119f8914f915433d3cdf846a1ddf8798 20f5eba9-8ca2-11f0-9328-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=216378 Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 0 0 0