20.500.12556/RUL-169492 Investigating cytoprotection by the dietary isfolavone Daidzein against palmitic acid cytotoxicity in a human neural cell line Preučevanje zaščitne vloge izoflavona daidzeina pred citotoksičnostjo palmitinske kisline na primeru celične linije človeških nevronov The Western diet, high in saturated fats and low in plant-based foods, is associated with metabolic diseases such as type II diabetes. Long-term dietary intervention with a diet high in plant-based foods, rich in phytochemicals has been shown to prevent such diseases. The reason for prevention is not known. We suspected it may be linked to antioxidant effects driven by the presence of phytochemicals in the diet. Phytochemicals are chemicals present in the plant-based part of diet that are not nutrients and do not provide energy or structural components, but they nonetheless influence metabolism. Since isoflavone daidzein is one of the most common dietary phytochemicals and palmitic acid is a dietary saturated fatty acid found in abundance in a Western diet, we investigated whether the dietary isoflavone daidzein is cytoprotective against saturated dietary palmitic acid induced cell damage in a human neural cell line SH-SY5Y. We did that by monitoring the gene expression of mitochondrial transcription factor A encoded by the TFAM gene. Mitochondria both generate reactive oxygen species (ROS) that drive redox sensitive events and respond to ROS-mediated changes in the cellular redox state. Acute stimulation with exogenous oxidants, such as palmitic acid, was shown to increase the concentration of ROS and in turn increase the expression of a key mitochondrial transcription factor TFAM. An increased expression of TFAM has been shown to have cytoprotective effects, since this gene is associated with mitochondrial DNA repair. Therefore, by monitoring the gene expression of TFAM we were able to determine whether daidzein increased expression of this gene and was therefore cytoprotective against palmitic acid induced cell damage. We cultured the cells in conditions with or without palmitic acid, extracted their RNA and used reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) to get the gene expression of the TFAM gene. Quercetin is an isoflavone, which was experimentally proven to increase the TFAM gene expression, so cells cultured with quercetin were used as positive control. Cells cultured without daidzein were used as negative control. As a reference gene, we monitored the gene expression of the B2M gene. The experiment was repeated twice and after both experiments, the statistical analysis showed that the differences in gene expression were not statistically relevant. Due to the high standard deviation, we can only conclude that to reduce the standard deviation between experimental replicates the experiment should be either optimised or repeated. Moderni prehrambeni vzorci, z velikim odstotkom nasičenih maščob in malim odstotkom zelenjave in sadja postajajo glavni krivec za rast odstotka metabolnih bolezni prebivalstva razvitih držav. Zahodnjaška dieta, značilna predvsem za razvite države zahodnega sveta je eden glavnih razlogov za hitro rast odstotka prebivalstva s prekomerno težo in odstotka metabolnih bolezni, asociiranih s prekomerno težo. Hiter preskok iz vnosa neprocesiranih “surovih” izdelkov, značilen za tradicionalne diete, na vnos zelo procesiranih izdelkov, značilen za moderne diete, človeškemu organizmu ni dal zadosti časa za evolucijske prilagoditve, ki bi omogočile nujne spremembe metabolizma in komenzalnih bakterij v človeškem metabolizmu [1][2][3]. Ena od bolezni, ki je v zadnjih letih doživela veliko rast je diabetes tipa II. Ta metabolna bolezen, ki je značilna za ljudi s prekomerno težo, se ponavadi pojavi v odraslih letih kot odziv na kronično prevelik vnos kalorij, ki povzroči nepravilno delovanje b-celic trebušne slinavke. Te celice so zaradi velikega vnosa hrane primorane stalno izražati inzulin, kar vodi do inzulinske rezistence. Ta inzulinska rezistenca b-celice prisili v še večje izražanje inzulina in s tem inzulinsko rezistenco sčasoma še poveča, dokler ta ne vodi do preobremenjenosti teh celic in njihovega propada. S propadom teh celic telo več ne more vzdrževati glukozne homeostaze v telesu, kar vodi do metabolnih komplikacij, ki se izražajo kot diabetes tipa II. Glede na to, da se diabetes tipa II izraža v veliki meri pri ljudeh s prekomerno težo, za katere je značilno prenajedanje in velik vnos sladkorja ter maščob, se današnje raziskave osredotočajo na to kako dieta posameznika in prevelik odstotek maščobnega tkiva, ki ga ta dieta povzroča vpliva na razvoj te bolezni [4][5][6]. Maščobno tkivo se v ljudeh deli na rjavo maščobno tkivo in belo maščobno tkivo, pri čemer belo maščobno tkivo v odraslih osebkih predstavlja veliko večino celotnega maščobnega tkiva v telesu. Belo maščobno tkivo, ki ohranja možnost raztezanja skozi celotno življensko obdobje je tako postalo glavna tarča raziskav [7][8][9][10]. Pretekle raziskave so pokazale, da je belo maščobno tkivo povezano z metabolnimi težavami, saj se ob prevelikem raztezanju, ki se pojavi ob kronično prevelikem vnosu kalorij, začne nabirati v nemaščobnih tkivih kot so jetra in mišice. To nabiranje maščob v nemaščobnih tkivih povzroča stres in nedelovanje tkiv, ki pripomorejo pri razvoju kardiovaskularnih bolezni, raka in drugih metabolnih bolezni, kot je diabetes tipa II. Razvoj teh bolezni pri ljudeh s prekomerno težo je tako pripomogel pri snovanju teorije o lipotoksičnosti, ki temelji na tem, da lipidi toksično vplivajo na inzulinsko signalizacijo in s tem povzročajo inzulinsko rezistenco pri bolnikih z diabetesom tipa II [11][12][13][14][15]. Lipotoksičnost je karakterizirana kot metabolna nepravilnost opažena pri daljši izpostavljenosti visokim koncentracijam prostih maščobnih kislin v telesu, ki pripomore k razvoju metabolnih bolezni in vnetja. Preveliko nabiranje maščobnih kislin v plazmi in prevelika aktivacija lipidnih signalnih poti povzroča celično nedelovanje in s tem inzulinsko rezistenco, mitohondrijsko fragmentacijo in oksidativno neravnotežje, ki se ponavadi prevesi v celično smrt. Glede na to, da je palmitinska kislina maščobna kislina z največjo koncentracijo v našem telesu je ta nasičena maščobna kislina najbolj verjeten krivec za lipotoksičnost. Kljub temu, da mehanizem lipotoksičnosti še vedno ni bil popolnoma definiran lahko z gotovostjo trdimo, da je zmanjšanje vnosa maščob ena od najbolj učinkovitih poti za preprečevanje asociiranih bolezni [16][17][18]. Za potencial spremembe diete in s tem vplivanje na celične procese ključne za preprečevanje diabetesa tipa II in drugih bolezni je bila pomembna predvsem povezava med enteričnim živčnim sistemom in metabolnimi boleznimi. Veliko diabetikov doživlja spremembe v gastrointestinalni gibljivosti, ponovljivost driske in tudi zaprtje, kar je znanstvenike vodilo do raziskovanja povezave med diabetesom in enteričnim živčnim sistemom, ki te spremembe v gastrointestinalnem traktu povzroča. Dokazali so, da enterični živčni sistem oživčuje tudi druge organe prebavil, kot je trebušna slinavka in s tem vpliva na aktivnost teh organov. Ta dokaz je glavna povezava med patološkimi težavami in diabetesom tipa II, ki predlaga, da sprememba diete lahko vpliva na spremembo delovanja drugih organov in s tem možnost zdravljenja bolezni kot je diabetes tipa II [24, 25, 26]. Trenutne raziskave so pokazale, da je ena od mogočih terapij za preprečevanje teh bolezni dolgoročna intervencija s hrano, bogato s fitokemikalijami. To so spojine, ki so pogoste v rastlinah in so zaradi njihovih antioksidativnih značilnosti postale tema raziskav. Ena od najbolj razširjenih fitokemikalij v človeški prehrani je izoflavon daidzein. Glede na njegovo strukturno podobnost naravnemu hormonu 17b-estradiolu ga lahko kvalificiramo kot fitoestrogen. Ta molekula se v človeškem telesu pretvori v molekulo imenovano Sekvol, ki ima večjo afiniteto do vezave na estrogenski receptor kot daidzein in predstavlja velik potencial za daidzein kot dodatek hrani za zmanjšanje metabolnih zapletov. Prav tako so nekatere študije pokazale, da prehrana bogata z daidzeinom v miših povzroča povečano koncentracijo protivnetnih maščobnih kislin, ki bi lahko zmanjšale vnetje povzročeno s strani drugih nasičenih maščobnih kislin [19][20][21][22][23]. Anitoksidativne značilnosti fitokemikalij naj bi bile pomembne predvsem v mitohondriju, kjer je homeostaza reaktivnih kisikovih zvrsti najbolj pomembna. Ta homeostaza je pri povečani koncentraciji nasičenih maščobnih kislin porušena in povzroča prej omenjene fragmentacije mitohondrija, s tem komplikacije v delovanju celic in celično smrt. Ena od predlaganih terapij bi bila, da bi s povečanim vnosom antioksidativnih spojin, kot je daidzein, zmanjšali koncentracijo reaktivnih spojin v mitohondriju, povzročeno s strani prevelike koncentracije citotoksične palmitinske kisline in drugih nasičenih maščobnih kislin [28][29][30][31]. Naša raziskava se je osredotočala na to kako povečan vnos daidzeina ob konstantni izpostavljenosti palmitinski kislini vpliva na izražanje gena za mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM). Ta raziskava temelji na študijah, ki so pokazale potencial dodajanja antioksidativnih fitokemikalij v dieti za protiutež palmitinski kislini, ki s svojo cititoksičnostjo povzroča oksidativen stres v mitohondrijih [30]. Naša hipoteza je bila, da bo z naraščajočo koncentracijo daidzeina v celični kulturi naraslo tudi izražanje TFAM gena, kar bo imelo antioksidanten učinek na oksidativno škodo povzročeno s palmitinsko kislino. Daidzein bo tako poskrbel za zmanjšanje koncentracije reaktivnih kisikovih zvrsti in s tem omogočil ponovno vzpostavitev homeostaze teh zvrsti v mitohondriju. SH-SY5Y celice so bile uporabljene kot model človeške nevronske celice, zaradi njihove konstantne proliferacije in dobrih zmožnosti oponašanja človeške celice [27]. Celice smo gojili v pogojih s palmitinsko kislino in različnimi koncentracijami daidzeina. Za negativno kontrolo smo celice gojili brez palmitinske kisline, za pozitivno kontrolo pa smo uporabili quercetin. Quercetin je izoflavon, ki je v preteklih raziskavah ob istih pogojih pokazal veliko povečanje izražanja preiskovanega gena. Antioksidativne lastnosti smo določali s spremljanjem izražanja gena TFAM, pri čemer smo za referenčni gen uporabili B2M gen, katerega izražanje se ob naših pogojih ne bi smelo spremeniti. Eksperiment smo ponovili dvakrat, da smo lahko na rezultatih izvedli statistično analizo. Naši rezultati so sprva pokazali nekaj variacije v izražanju genov glede na različne koncentracije daidzeina, vendar je bila standardna deviacija med eksperimentalnimi ponovitvami prevelika. Zaradi visoke standardne deviacije, ki je v ekstremnem primeru znašala kar 0,59 oziroma 59 % smo opravili še statistični T-test. P-vrednost za statistično značilne razlike je pri tem znašala 0,05, oziroma 5 %. Vse naše p-vrednosti so bile višje od 0,05 iz česa lahko zaključimo, da nismo dobili niti enega statistično značilnega rezultata. Z nadaljnjo statistično analizo smo ugotovili, da bi z našo standardno deviacijo dobili statistično značilne rezultate, če bi eksperiment ponovili 10- krat. Ti rezultati nam povedo, da moramo za kakršnekoli zaključke o vplivu daidzeina na citotoksičnost palmitinske kisline eksperiment ali ponoviti ali pa optimizirati in s tem zmanjšati standardno deviacijo. Glede na to, da en eksperiment vzame veliko časa predlagamo zmanjšanje standardne deviacije z optimizacijo eksperimenta. Eden od možnih pristopov bi bil štetje celic pred vsakim poskusom in s tem zagotovitev, da je število celic konstantno. Z našim eksperimentom smo s spremljanjem izražanja gena uspeli določiti število eksperimentov potrebnih za pridobitev statistično značilnih rezultatov o citozaščiti izoflavona daidzeina na citotoksičnost inducirano s palmitinsko kislino, pri opaženi standardni deviaciji. Naša raziskava je lahko uporabljena kot pilotna raziskava za prihodnje raziskave z optimiziranim eksperimentalnim postopkom in večjim številom eksperimentalnih ponovitev. type II diabetes daidzein palmitic acid cytotoxicity diabetes tipa II daidzein palmitinska kislina citotoksičnost true false false Angleški jezik Slovenski jezik Diplomsko delo/naloga 2025-05-30 08:50:00 2025-05-30 08:50:19 2025-06-06 11:13:59 0000-00-00 00:00:00 2025 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 23072 238530051 Kresal_Martin_-_Preucevanje_zascitne_vloge_izoflavona_daidzeina_pred_citotoksicnostjo_palmitinsk.pdf Kresal_Martin_-_Preucevanje_zascitne_vloge_izoflavona_daidzeina_pred_citotoksicnostjo_palmitinsk.pdf 1 5F77DAC96DB352BAFB0118A4206EC8F8 ec9e1d8390b645bd9aebe56d9cd8917744c8efd77a40f8b69c5c8498585a448e 0c6f39a3-3d21-11f0-b232-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=210903 Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 0 0 0