20.500.12556/RUL-168422 Mikroskopija STED s tremi barvili Three-colour STED microscopy Mikroskopija STED predstavlja napreden pristop k fluorescentnemu slikanju, ki omogoča doseganje visoke prostorske ločljivosti. V naši študiji smo preučili učinkovitost mikroskopije STED pri uporabi treh barvil hkrati: ATTO 490LS DPPE, LIVE ORANGE Mito in SiR Actin, s katerimi smo označili različne celične strukture (membrano, mitohondrije in aktinske filamente) v živih fibroblastih, izoliranih iz mišjih pljučnih celic. Raziskali smo, kakšno ločljivost lahko dosežemo s konfokalnim načinom snemanja pri uporabi različnih moči laserja STED. Pri moči laserja STED 98 mW (30 %) smo dosegli ločljivost pod 100 nm za vsa tri barvila, najboljšo pa pri barvilu LIVE ORANGE Mito, ki je znašala približno 76 nm. Pri narejenih eksperimentih smo opazili težave s spektralnim puščanjem signalov enega barvila v spektralna okna drugih barvil. Da bi rešili ta problem, smo uporabili metodologijo spektralne dekompozicije. Ta metoda je omogočila učinkovito ločevanje signalov barvil, kar je bil glavni cilj naše naloge. Signal barvila v napačnem spektralnem oknu se je večinoma zmanjšal z 20 % na manj kot 5 %. Spektralna dekompozicija nam omogoča ločevanje fluorescentnih signalov iz kompleksnih slik, kar pomaga k natančnejši analizi distribucije barvil ter izboljšuje vizualizacijo in interpretacijo celičnih struktur. To tehniko lahko uporabimo pri raziskavah celične dinamike, prepoznavanju patoloških sprememb in oceni učinkovitosti zdravljenja ter pri preučevanju odziva na terapijo. Zaradi svoje natančnosti je pomembna tehnika v biofiziki za razumevanje bioloških procesov in struktur. STED microscopy represents an advanced approach to fluorescence imaging, enabling high spatial resolution. In our study, we examined the effectiveness of STED microscopy using three dyes simultaneously: ATTO 490LS DPPE, LIVE ORANGE Mito, and SiR Actin, which we used to label different cellular structures (membrane, mitochondria and actin filaments) in live fibroblasts isolated from mouse lung cells. We investigated the resolution achievable with confocal imaging and varying STED laser powers. With a STED laser power of 98 mW (30 %), we achieved a resolution below 100 nm for all three dyes, with the best resolution of approximately 76 nm using the LIVE ORANGE Mito dye. In the experiments, we observed issues with spectral crosstalk, where the signal from one dye leaked into the spectral windows of the other dyes. To address this issue, we applied a spectral decomposition methodology, which allowed effective separation of the dye signals, a key goal of our study. The signal of a dye in an incorrect spectral window was mainly reduced from 20 % to less than 5 %. Spectral decomposition enables the separation of fluorescent signals from complex images, aiding in the precise analysis of dye distribution and improving the visualization and interpretation of cellular structures. This technique can be used in studies of cellular dynamics, the identification of pathological changes, the evaluation of treatment efficacy, and the study of therapeutic responses. Due to its precision, it is an important technique in biophysics for understanding biological processes and structures. mikroskopija STED fluorescentna barvila fibroblasti ločljivost spektralna dekompozicija STED microscopy fluorescent dyes fibroblasts resolution spectral decomposition true false false Slovenski jezik Angleški jezik Magistrsko delo/naloga 2025-04-12 08:15:47 2025-04-12 08:15:58 2025-04-14 11:47:08 0000-00-00 00:00:00 2025 0 0 0000-00-00 NiDoloceno NiDoloceno NiDoloceno 0000-00-00 0000-00-00 0000-00-00 150155 229084163 16695.pdf 16695.pdf 1 DF0378AEA0C3E3EF8F3D4B748E4D7D2F 1b7cd49a003e5fa3577bd59716df6531c32e749781336e29ee5419513ae6c6c1 807682be-1764-11f0-b232-0050569b8976 https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=201831 Fakulteta za matematiko in fiziko 0 0 0