Optimizacija izbijanja tarčnega gena v krompirju s tehnologijo CRISPR/Cas9Luskar, Lucija (Avtor)
Gruden, Kristina (Mentor)
Lukan, Tjaša (Komentor)
biotehnologijatarčna mutagenezakrompirCRISPR Cas9Tarčno izbijanje ali mutageneza nam omogoča študij funkcije posameznega gena. Namen naše raziskave je bil optimizirati metodo za izbijanje genov CRISPR Cas9 pri krompirju. Za tarčni gen smo si izbrali gen StRbohD, ki nosi zapis za oksidazo NADPH, ki je vključena v odziv krompirja na krompirjev virus Y. Utišanje tega gen s tehnologijo kratkih lasničnih RNA vodi v slabšo odpornost rastlin Rywal na PVY. Virus se po okužbi teh rastlin lahko razširi v zgornje neokužene liste, pri čemer pride do nastanka nekrotičnih lezij. Načrtovano vodilno RNA, ki je homologna delu zaporedja gena StRbohD, smo vnesli v plazmid pRGEB31, ki med drugim vsebuje tudi zapis za encim Cas9. S konstruktom smo transformirali krompir sorte Rywal. Iz transformiranih poganjkov smo vzgojili 70 linij. 36 naključno izbranih linij smo okužili z virusom PVY N605-GFP in spremljali pojav simptomov. Pet linij je razvilo lezije v zgornjih neinokuliranih listih. Prisotnost virusne RNA smo potrdili tudi s qPCR. Pri dveh linijah smo spremljali število lezij na okuženih listih v daljšem časovnem obdobju. Ena od linij je izstopala po visokem številu lezij na okuženih listih, ki je primerljivo oziroma večje od števila lezij na okuženih listih krompirja genotipa NahG-Rywal, občutljivega na okužbo s PVY. S sekvenciranjem tarčnega zaporedja gena StRbohD testiranih linij nismo našli sprememb, zato bo potrebno spremembe poiskati v širšem območju tarčnega gena.[L. Luskar]20192019-06-16 07:45:18Magistrsko delo/naloga108107UDK: 601.4:575.224.4:577.21:602.64:582.930.11(043.2)VisID: 163851COBISS_ID: 9239161sl