Uporabnost nano-protiteles za razvoj ciljanega zdravljenja glioblastomaŠamec, Neja (Avtor)
Komel, Radovan (Mentor)
glioblastom multiformebio-označevalec TUFMnano-protitelesacitotoksičnostGlioblastom multiforme (GBM) je gliom, tumor osrednjega živčnega sistema, najpogostejša oblika možganskega tumorja, za katerim zboli 3-5 bolnikov na 100.000 ljudi. Povprečni čas preživetja bolnikov z GBM je od časa diagnosticiranja 12 do 18 mesecev, ob kombinirani postoperativni terapiji z uporabo temozolomida. Genetska heterogenost GBM je posledica glioblastomskih matičnih celic (GMC). GMC zaradi svoje odpornosti proti kemoterapevtikom in radioterapiji uspešno napadajo zdravo okoljsko tkivo. Zdravljenje je dodatno oteženo zaradi krvno-možganske pregrade (KMP), saj je prehod kemoterapevtikov skozi njo zelo otežen. Za izboljšanje zdravljenja GBM in izid za bolnika je potrebna stalna dostava zdravil v celice glioma, obenem pa je potrebno zmanjšati učinek zdravil na sosednje, zdrave nevrone in celice glije. Novi pristopi zdravljenja GBM so zato zelo zaželeni in potrebni. Za razvoj usmerjenega zdravljenja pa še vedno potrebujemo odkritje bolj specifičnih biomolekularnih označevalcev GMC, kot tudi njihovih tarčnih zdravil, ki bi prehajala KMP. To lahko dosežemo s proteomskim pristopom, ki temelji na nano-protitelesih, ki so eno-domenski antigen-vezavni fragmenti, pridobljeni iz kemelidnih težkoverižnih protiteles, ki zaradi svoje majhnosti lahko prehajajo KMP.
V doktorski nalogi smo izdelali knjižnico nano-protiteles in opravili njihovo imunoafinitetno obogatitev, izvedeno na celotnih GMC, in tako pridobili nano-protitelo, specifično za bio-označevalec GMC. Z masno spektrometrijo smo ugotovili, da je nov bio-označevalec mitohondrijski translacijsko-elongacijski dejavnik TUFM. Diferenčno izražanje TUFM smo proučevali na ravni proteinov in mRNA, in sicer v celičnih linijah GBM (U87MG in U251MG), GMC in tkivih GBM, v primerjavi z izražanjem v nevralnih matičnih celicah (NSC) in normalnih možganskih tkivih. S prenosom western smo na ravni proteinov ter qPCR na ravni mRNA potrdili nadizražanje TUFM v GMC. Z imunohistokemijo, na tkivnih rezinah, vklopljenih v parafin, smo potrdili nadizražanje TUFM v tkivih GBM, v normalnem možganskem tkivu pa se TUFM ni izražal. Z imunocitokemijo smo potrdili vstop nano-protitelesa anti-TUFM v GBM celice U87MG, U251MG in GMC ter njegovo vezavo v območje mitohondrijev. Citotoksičnost vezave nano-protitelesa anti-TUFM na antigen smo preverili z metabolnimi testi na celičnih linijah GBM (U87MG in U251MG), GMC ter kontrolnih celičnih linijah – astrocitih, nevralnih matičnih celicah in človeških nesmrtnih keratinocitih. Nano-protitelo anti-TUFM je imelo citotoksičen učinek na vse celične linije GBM, medtem ko toksičnosti anti-TUFM na kontrolnih celičnih linijah nismo opazili.
Z vklapljanjem nano-protiteles anti-TUFM v arheosome smo preverili ali obstaja boljši oz. bolj učinkovit dostavni sistem za vnos nano-protitelesa anti-TUFM v celice. Arheosomi niso citotoksični in vivo in imajo edinstvene strukturne lastnosti, ki so osnova za razvoj novih dostavnih sistemov zdravil. Te lastnosti so stabilnost pri visokih temperaturah, nizkem oz. visokem pH, odpornost proti fosolipazam in solem žolčnih kislin ter manjša membranska prepustnost. Nano-protitelesa anti-TUFM smo uspešno vklopili v arheosome in ugotovili, da le-ti vstopajo v celice GBM, U251MG in U87MG. Ugotovili smo, da ima nano-protitelo anti-TUFM, vklopljeno v arheosom, na celice GBM manjši citotoksični učinek kot ga ima samo nano-protitelo anti-TUFM.
V doktorski nalogi smo dokazali specifičnost in izrazit zaviralni učinek nano-protitelesa anti-TUFM na rast GMC, kar bi lahko v prihodnje pripomoglo k razvoju specifičnega pristopa za zdravljenje glioblastoma.20182018-06-07 07:45:37Doktorsko delo/naloga101471VisID: 10350COBISS_ID: 33797337sl