Molekularna opredelitev, klinični pomen in tkivni tropizem novega človeškega papilomavirusa, HPV-204 in sorodnih genotipovŠterbenc, Anja (Avtor) Poljak, Mario (Mentor) človeški papilomavirusiHPVHPV-204Mupapillomavirusnov genotip HPVmolekularna opredelitevfilogenetska analizaklinični pomentkivni tropizempodtipske različiceČloveške papilomaviruse (HPV) etiološko povezujemo z nastankom številnih benignih in malignih sprememb kože in sluznic pri ljudeh. Po podatkih Mednarodnega referenčnega centra za HPV je bilo do novembra 2017 uradno priznanih 206 genotipov HPV, nedavno pa so dokazali, da naj bi obstajalo še vsaj 400 potencialno novih, še neopredeljenih genotipov HPV. Naša raziskovalna skupina je leta 2014 v vzorcu analnega brisa dokazala prisotnost novega genotipa HPV, HPV-204, ki smo ga uvrstili v rod Mupapillomavirus (Mu-PV), kamor sta bila do tedaj uvrščena le dva genotipa HPV (HPV-1 in HPV-63). V doktorski nalogi smo želeli natančno filogenetsko in molekularno opredeliti HPV-204. Poleg tega smo na podlagi testiranja reprezentativne zbirke kliničnih vzorcev želeli opredeliti tkivni tropizem in klinični pomen novega genotipa HPV-204 ter sorodnih genotipov HPV-1 in HPV-63. V zadnjem delu doktorske naloge smo želeli opredeliti genetsko raznolikost genotipov iz rodu Mu-PV s pomnoževanjem in neposrednim določanjem nukleotidnega zaporedja nekodirajočega genomskega področja (LCR). S pomočjo več programov in prosto dostopnih spletnih aplikacij smo v prvem delu doktorske naloge opredelili značilna genomska področja celotnega virusnega genoma HPV-204. Celotno nukleotidno zaporedje HPV-204 je sestavljeno iz 7.227 baznih parov (bp) s 37,8% deležem bp gvanin-citozin. HPV-204 izkazuje organizacijo genoma, ki je značilna za predstavnike rodu Mu-PV, saj vsebuje zapis za šest zgodnjih (E6, E7, E1, E2, E8 in E4) in dve pozni (L1 in L2) virusni beljakovini, vendar nima zapisa za zgodnjo beljakovino E5. Na podlagi filogenetske analize gena L1 vseh uradno priznanih genotipov HPV smo potrdili preliminarno uvrstitev HPV-204 v rod Mu-PV, in sicer v novo vrsto Mu-3, pri čemer lahko sklepamo, da je HPV-204 najbolj soroden s HPV63, s katerim izkazuje 66,9% skladnost v genu L1, medtem ko s HPV-1 izkazuje 66,1% skladnost v genu L1. Tkivni tropizem in klinični pomen okužb z genotipi iz rodu Mu-PV smo opredelili s testiranjem reprezentativne zbirke kliničnih vzorcev (n=1.006), za kar smo razvili in uvedli analitično zelo občutljive kvantitativne HPV-204, HPV-1 in HPV-63 tipsko-značilne reakcije pomnoževanja s polimerazo v realnem času (RT-PCR). Odkrili smo 11 neodvisnih izolatov HPV-204, in sicer v brisu materničnega vratu (1/116; 0,8%), vzorcu kožne bradavice (1/43; 2,3%), brisih analnega kanala (4/110; 3,6%) in brisih penisa (5/110; 4,5%). V sklopu doktorske naloge smo skupno odkrili 27 neodvisnih izolatov HPV-1, ki smo jih odkrili v brisih nosnega dela žrela (2/110; 1,8%), dlačnem mešičku obrvi (1/110; 0,9%), vzorcih kožnih bradavic (21/43; 48,8%) in vzorcih anogenitalnih bradavic (3/40; 7,5%), ter 19 neodvisnih izolatov HPV-63, ki smo jih odkrili v brisih nosnega dela žrela (3/110; 2,7%), brisih ustne votline (2/105; 1,9%), dlačnih mešičkih obrvi (4/110; 3,6%), vzorcih kožnih bradavic (9/43; 20,9%) in brisu analnega kanala (1/110; 0,9%). Na podlagi testiranja arhivskih vzorcev benignih in malignih sprememb ter klinično nespremenjene kože in sluznic smo dokazali, da vsi genotipi iz rodu Mu-PV izkazujejo dvojni tkivni tropizem. V vzorcu kožne bradavice, v katerem smo dokazali HPV-204, je bilo virusno breme HPV-204 izjemno nizko (7,4 x 10-7 virusnih kopij/celico), kar nakazuje na latentno, klinično nepomembno okužbo. Čeprav je bilo virusno breme HPV-1 večinoma nizko (razpon 5,9 x 10-6 – 1,8 x 10-2 virusnih kopij/celico), je bil HPV-1 najverjetnejši povzročitelj treh kožnih bradavic, v katerih smo dokazali visoko virusno breme HPV-1 (razpon 8,5 x 103 – 5,2 x 104 virusnih kopij/celico). Virusno breme HPV-63 je bilo podobno kot pri HPV-1 v večini vzorcev nizko (razpon 3,2 x 10-6 – 1,1 x 10-2 virusnih kopij/celico), HPV-63 pa je predstavljal najverjetnejšega povzročitelja le v vzorcu kožne bradavice z visokim virusnim bremenom (3,9 x 102 virusnih kopij/reakcijo). Z opredelitvijo virusnega bremena HPV-204, HPV-1 in HPV-63 smo potrdili, da je okužba s temi genotipi HPV večinoma klinično neaktivna, pri čemer sta HPV-1 in HPV-63 etiološka povzročitelja zgolj posameznih kožnih bradavic, medtem ko HPV-204 nismo uspeli povezati z nastankom kožnih bradavic. V zadnjem delu doktorske naloge smo na osnovi analize nukleotidnega zaporedja nekodirajočega genomskega področja LCR genotipov iz rodu Mu-PV odkrili eno podtipsko različico HPV-204, ki je vsebovala eno točkasto mutacijo, šest podtipskih različic HPV-1, ki so vsebovale 1-19 nukleotidnih zamenjav oziroma izpadov, ter dve podtipski različici HPV-63, pri čemer je prva podtipska različica vsebovala 13, druga pa šest nukleotidnih zamenjav oziroma izpadov. Predvidevamo, da opredeljene podtipske različice posameznih genotipov HPV niso povezane z značilno klinično sliko ali anatomskim področjem okužbe. Izsledke raziskave, ki so predstavljeni v doktorski nalogi, smo objavili kot znanstveni raziskovalni članek v reviji, ki jo citira Science Citation Index (SCI) (IF2016=2,806): Šterbenc A, Hošnjak L, Chouhy D, Bolatti EM, Oštrbenk A, Seme K, Kocjan BJ, Luzar B, Giri AA, Poljak M. Molecular characterization, tissue tropism, and genetic variability of the novel Mupapillomavirus type HPV204 and phylogenetically related types HPV1 and HPV63. PLoS One 2017;12:e0175892.20182018-01-25 07:15:06Doktorsko delo/naloga99466VisID: 9278COBISS_ID: 293606656sl