Kinetika vezave ekvinatoksina II na lipidne kapljice in velike unilamelarne vezikleVončina, Blaž (Avtor) Maček, Peter (Mentor) ekvinatoksin IIveliki unilamelarni veziklilipidne kapljicesfingomielinlipidni dvoslojlipidni monoslojholesterolhemolizatriptofanska fluorescencaporaactinia equinaEkvinatoksin II (Eqt II) je proteinski toksin iz konjske morske vetrnice (Actinia equina), ki ga uvrščamo v družino aktinoporinov. Vetrnicam služi za plenjenje in obrambo pred plenilci. Eqt II tvori kationsko selektivne pore v tarčnih lipidnih membranah. Proces tvorjenja pore vključuje vezavo Eqt II na sfingomielin (SM), ki se nahaja v lipidnih membranah, vstavitev N-terminalne α-vijačnice v membrano, oligomerizacijo ter nastanek pore. Namen naloge je bil preučiti razliko med vezavo Eqt II na lipidni dvosloj, ki ga vsebujejo veliki unilamelarni vezikli (LUV), in vezavo na lipidni monosloj, ki ga vsebujejo lipidne kapljice (LK). Preučevali smo tudi vpliv N-terminalne α-vijačnice na začetno vezavo toksina. Že pripravljene plazmide z zapisom za mutanta Eqt IIV8C,K69C smo namnožili v bakterijskem sevu Escherichia coli DH5α. Ekspresijo s plazmidom vstavljenih genov smo inducirali z dodatkom 0,5 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida v bakterijsko kulturo. S pomočjo stresanja, soniciranja in centrifugiranja smo iz bakterijske usedline izolirali Eqt IIV8C,K69C. Tega smo nato očistili z ionsko-izmenjevalno in gelsko kromatografijo ter ga skoncentrirali z ultrafiltracijo. Pripravili smo reducirano različico mutanta Eqt IIV8C,K69C, pri katerem se lahko N-terminalna α-vijačnica prosto giblje, ter oksidirano različico mutanta, pri kateri je gibanje N-terminalne α-vijačnice onemogočeno zaradi disulfidnega mostička, ki nastane med jedrom molekule in N-terminalno α-vijačnico. Koncentracije lipidov v pripravljenih LUV in LK smo določili s pomočjo kompletov za določanje koncentracije lipidov. Eksperiment smo izvedli na fluorimetru z napravo za hitro pomešanje reagentov. Ob vgradnji triptofanskih ostankov (ti se nahajajo na vezavnem delu molekule Eqt II) v nepolarno membrano pride do povečanja fluorescence. Izmerjene spremembe intenzitete fluorescence smo opisali z matematičnim modelom psevdo-prvega reda reakcij adsorpcije. K eksperimentalnim krivuljam smo prilegali monoeksponentne krivulje. Ob vezavi reduciranega mutanta Eqt IIV8C,K69C, tako na LUV kot tudi na LK, smo izmerili večjo intenziteto maksimalne fluorescence kot ob vezavi oksidiranega mutanta Eqt IIV8C,K69C. Menimo, da je to posledica negibljive N-terminalne α-vijačnice pri oksidiranemu mutantu, ki predstavlja oviro, zaradi katere se triptofanski ostanki v lipidno membrano vgradijo manj globoko. Ob vezavi na LUV (tako v primeru oksidiranega kot tudi reduciranega mutanta Eqt IIV8C,K69C) smo izmerili nekoliko večje intenzitete maksimalne fluorescence kot ob vezavi na LK. To kaže na nekoliko večjo dostopnost SM v dvoslojni lipidni membrani LUV kot SM v lipidnem monosloju LK. Večja sposobnost vezave Eqt II na LUV bi lahko bila tudi posledica nekoliko večjega razmerja v koncentracijah med holesterolom in SM v LUV v primerjavi z istim razmerjem v LK, saj membranski holesterol ojača vezavo aktinoporinov na SM. Bistvenih razlik med začetno vezavo Eqt II na LUV in LK nismo odkrili.20172018-01-12 07:15:09Magistrsko delo/naloga99311VisID: 150700COBISS_ID: 4566607sl