Indukcija mestno specifičnih mutacij z vnosom ribonukleoproteinskih kompleksov v protoplaste oljne ogrščice (Brassica napus L.)Mazinjanin, Sabina (Avtor) Murovec, Jana (Mentor) oljna ogrščicaprotoplastitransformacijaPEGtarčna mutagenezaCRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 je kot orodje genskega inženirstva vse pomembnejše pri tarčnem preurejanju genomov rastlin. Neposreden vnos sgRNA in proteina Cas9 v protoplaste rastlinskih vrst s pomočjo PEG je ena izmed metod, ki omogoča mutagenezo genoma brez transgeneze. V protoplaste oljne ogrščice (Brassica napus L.) smo želeli s pomočjo PEG vnesti ribonukleoproteinske komplekse in s tem inducirati tarčne mutacije brez genske transformacije rastlin. V ta namen smo optimizirali pripravo rastlinskega materiala, sestavo encimske raztopine za razgradnjo celične stene ter sam postopek izolacije protoplastov. Ugotovili smo, da so kot izhodni material najprimernejši etiolirani hipokotili, za ustrezno razgradnjo celične stene pa sta se za najprimernejši izkazali celulazi Onozuka R-10 in Onozuka RS. Najprimernejši postopek izolacije smo izbrali na podlagi živosti in koncentracije protoplastov ter uspešnosti vnosa ekspresijskega plazmida z genom ZsGreen. Za tarčno mutagenezo protoplastov smo uporabili štiri različne sgRNA, s tarčami znotraj gena pds, ki smo jih v kompleksu z encimom Cas9 vnašali s pomočjo PEG. Po 48 urni inkubaciji smo iz protoplastov izolirali DNA in s pomočjo endonukleaze T7, RFLP analize ter z metodo sekvenciranja po Sangerju skušali identificirati morebitne tarčne mutacije. Rezultati encimskih testov so nakazovali uspešno indukcijo tarčnih mutacij, vendar jih s sekvenčno analizo po Sangerju nismo mogli z gotovostjo potrditi. Za izboljšanje rezultatov bi bila potrebna nadaljnja optimizacija postopka izolacije protoplastov in/ali transformacije ter uporaba občutljivejše metode identifikacije mutacij.[S. Mazinjanin]20172017-10-07 07:15:43Magistrsko delo/naloga96652UDK: 633.853.492:631.528.1:601.4:575.224.4(043.2)VisID: 146693COBISS_ID: 8801145sl