Razvoj umetnih transkripcijskih dejavnikov na osnovi proteinov Cas9 za regulacijo regulatornih T-celic.Praznik, Arne (Avtor) Horvat, Simon (Mentor) CRISPRdCas9diabetes tipa 1FOXP3regulatorne celice TplazmidiHEK293T celicetransfekcijaaktivacija izražanjaregulacija genovtranskripcijski faktorjiAvtoimunske bolezni, med katere spada tudi diabetes tipa 1, se pogosto razvijejo kot posledica upada mehanizmov imunske tolerance. Pomemben del slednje predstavljajo podskupina T limfocitov, imenovanih regulatorne T celice (Treg), ki s svojo imunosupresivno funkcijo preprečujejo avtoimunsko delovanje lastnih celic in katerih umanjkanje ali nedelovanje je lahko pogosto pomemben faktor v razvoju avtoimunskih bolezni. Za njihov razvoj iz timocitov je ključno stabilno izražanje transkripcijskega faktorja FOXP3, ki deluje kot glavni regulator diferenciacije Treg. Zadostna aktivacija izražanja FOXP3 v drugih T-limfocitih ali celo sorodstveno bolj oddaljenih celicah bi lahko bil zadosten signal za diferenciacijo v Treg in pridobitev imunosupresivnega fenotipa. V magistrskem delu smo poskušali ustvariti in preizkusiti transkripcijske dejavnike, vezane na Cas9 proteine, za specifično aktivacijo izražanja FOXP3. Za usmerjanje Cas9 proteinov na tarčno mesto smo ustvarili različne vodilne RNA (sgRNA) molekule, ki so prepoznale specifična mesta na ključnih regulatornih mestih gena FOXP3. S poskusi in vivo smo dosegli visoko povišanje ob uporabi trodelnega aktivatorja VPR, vezanega na Cas9 protein z izničeno nukleazno aktivnostjo (dCas9:VPR). Najvišjo aktivacijo izražanja FOXP3 smo dobili ob ciljanju promotorske regije gena FOXP3 ter regulatorne regije, katero smo poimenovali Cage1. Po optimizaciji aktivacije izražanja smo prav tako preverili spremembo izražanja ključnih tarčnih genov proteina FOXP3 v celicah, ki imajo FOXP3 utišan. Uvodni poskusi aktivacije izražanja FOXP3 v celični liniji HEK293T so pokazali določeno mero ujemanja izražanja tarčnih genov s Treg celicami. Z nalogo smo pokazali moč metode za tarčno aktivacijo izražanja ter potrdili pomembnost regije Cage1 za tarčno aktivacijo. Metoda bi lahko bila močno orodje pri poskusih diferenciacije celic v Treg, kar bi lahko bilo zlasti pomembno pri terapijah za razne avtoimunske bolezni.[A. Praznik]20172017-05-07 07:15:11Magistrsko delo/naloga92251UDK: 577.27:606.61:602.6(043.2)VisID: 130679COBISS_ID: 8723833sl