UPORABA TEORETIČNIH MODELOV ELEKTROPORACIJE LIPIDNE MEMBRANERems, Lea (Avtor) Miklavčič, Damijan (Mentor) elektroporacijabiološka celicatkivoliposomzlivanje celickrioprezervacijapora v lipidnem dvoslojuprevodnost porenumerično modeliranjesimulacije molekularne dinamikeV doktorski disertaciji smo pokazali, da lahko z numeričnimi modeli učinkovito prispevamo k eksperimentalnim raziskavam. Numerični modeli sicer ne morejo nadomestiti eksperimentov, lahko pa vodijo začetni razvoj eksperimentalnega protokola in njegovo nadaljnjo optimizacijo, ter pripomorejo k interpretaciji eksperimentalnih rezultatov. Povezave med modeli na molekularni ravni, ravni celice in ravni tkiva so dosegljive in pomembne za napredovanje v razumevanju elektroporacije, s tem pa posledično razvoju učinkovitejših terapij in tehnologij. Eksperimentalni protokol za zlivanje različno velikih bioloških celic z električnimi pulzi trajanja največ nekaj sto nanosekund. Elektrozlivanje je vzpostavljena metoda za proizvodnjo hibridnih celic. Za razliko od kemičnih in virusnih metod, je elektrozlivanje fizikalna metoda, zato jo lahko varno uporabljamo tudi v kliniki. Pri elektrozlivanju je pomembno, da celice preživijo izpostavitev električnim pulzom, saj lahko le tako pridobimo žive zlite celice. Pri večini aplikacij si želimo doseči zlivanje med celicami različnega tipa. Če se celice močno razlikujejo v velikosti, lahko to predstavlja težavo pri elektrozlivanju, saj lahko večje celice postanejo poškodovane pri parametrih električnih pulzov, ki so potrebni za elektroporacijo manjših celic. Večje celice se namreč običajno elektroporirajo pri nižjih jakostih električnega polja kot manjše celice, posebej kadar dovajamo običajne pulze z dolžino nekaj 10 μs in več. Z uporabo numeričnega modeliranja smo pokazali, da lahko s pulzi dolžine v področju nanosekund dosežemo selektivno elektroporacijo stikov med celicami, ne glede na velikost celic. Nanosekundni pulzi tako lahko omogočijo elektrozlivanje celic različnih velikosti, ne da bi pri tem poškodovali celice. Na podlagi predpostavk numeričnih izračunov smo razvili uspešen eksperimentalni protokol za elektrozlivanje celic z nanosekundnimi pulzi. Rezultati eksperimentov pa so potrdili napovedi numeričnega modela. Numerični model biološkega tkiva z razločeno celično strukturo, ki omogoča načrtovanje elektroporacije tega tkiva Numerični modeli elektroporacije tkiva običajno obravnavajo tkivo kot homogeno strukturo s povprečnimi električnimi lastnostmi. Pri heterogenih tkivih je takšna obravnava preveč poenostavljena, saj heterogenost celične strukture povzroči nemohogeno porazdelitev električnega polja v tkivu. Modeliranje heterogenih tkiv kot homogeno strukturo tako lahko vodi do nepravilne interpretacije numeričnih rezultatov. Pri protokolih elektroporacije, kjer je preživetje celic ključnega pomena, je hkrati tudi pomembno, da pri načrtovanju protokolov upoštevamo heterogenost tkivne strukture. Napredek v razvoju modelov tkiv z razločeno celično strukturo ima torej visok pomen. Krioprezervacija predstavlja primer aplikacije, kjer morajo električni pulzi zagotoviti elektroporacijo vseh celic v tkivu, kar omogoči da krioprotektant vstopi v vse celice in jih ščiti med zamrzovanjem. Hkrati pa električni pulzi tudi ne smejo poškodovati celic. V namen optimizacije krioprezervacije špinače smo razvili numerični model z razločeno celično strukturo špinačnega lista. Model je bil validiran na podlagi meritev električnih lastnosti špinačnih listov v frekvenčni domeni in z meritvami električnega toka skozi list med dovajanjem elektroporacijskih pulzov. Ta model je prvi numerični model elektroporacije tkiva, ki upošteva celotno celično strukturo tkiva. Postopek, po katerem smo razvili model, pa lahko vodi nadaljnji razvoj podobnih modelov za druge tipe tkiva. Numerični model prevodnosti vodne pore v lipidnem dvosloju, validiran s simulacijami molekularne dinamike Prevodnost pore je eden najpomebnejših parametrov, ki premošča teoretične in eksperimentalne študije vodnih por, ki nastanejo v lipidnem dvosloju pod vplivom vsiljene transmembranske napetosti (tj. elektroporacije). Simulacije molekularne dinamike namreč ponujajo možnost študije por na molekularnem nivoju, pri eksperimentih na ravninskih lipidnih dvoslojih pa raziskovanje por poteka preko meritev njihove prevodnosti. Most med eksperimentalnimi študijami in simulacijami molekularne dinamike ponujajo modeli, ki sistem opisujejo s strani zveznih teorij. V namen učinkovite premostitve smo razvili numerični Poisson-Nernst- Planckov model ionskega toka prek lipidne pore. Model je bil zgrajen neposredno po molekularnem sistemu, s katerim smo izmerili prevodnost por s pomočjo simulacij molekularne dinamike. S kvantitativno primerjavo med napovedmi modela in rezultati, ki smo jih pridobili z analizo simulacij, smo numerični model validirali. Ta model predstavlja prvo direktno replikacijo molekularnega sistema z numeričnim modelom v smislu ionske prevodnosti lipidne pore. Pričakujemo lahko, da bo ta model prispeval k učinkovitejši karakterizaciji lipidnih por v eksperimentalnih študijah, hkrati pa lahko pričakujemo, da bo izboljšal tudi napovedi modelov, ki opisujejo elektroporacijo celičnih membran.20162016-02-23 13:30:08Doktorsko delo/naloga80624VisID: 34387COBISS_ID: 11300948sl