Kloniranje in izražanje človeške kaspaze-1 ter vrednotenje njene encimske aktivnostiUršič, Nika (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) Kocjančič, Metka (Komentor) kaspaza-1rekombinantni proteinizražanje v E. coliinkluzijska telescazaviralci kaspaze-1Kaspaza-1 je cisteinsko-aspartatna proteaza, ki ima ključno vlogo pri vnetnem odzivu, saj omogoča zorenje provnetnih citokinov interlevkina-1β in interlevkina-18 ter sodeluje pri piroptozi. Zaradi svoje pomembne vloge pri razvoju številnih bolezni predstavlja pomembno tarčo za razvoj novih zdravilnih učinkovin. Namen magistrskega dela je bil pripraviti rekombinantno človeško kaspazo-1 za uporabo pri vrednotenju potencialnih selektivnih zaviralcev, sintetiziranih na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani, ter testirati nekatere izmed njih. Pripravili smo dva ekspresijska plazmida, prvi je vseboval zapis za podenoto p10, drugi zapis za podenoto p20 človeške kaspaze-1. Izhajali smo iz komercialne komplementarne DNA človeške kaspaze-1, iz katere smo pomnožili zapisa za obe podenoti. Po uspešni ligaciji s plazmidom pET22b smo z vektorjema pET22b/p10 in pET22b/p20 transformirali klonirni sev E. coli TOP10. Konstrukta smo potrdili s sekvenciranjem po Sangerju ter z njima nadalje transformirali ekspresijski sev E. coli BL21-CodonPlus. Izvedli smo tri poskuse ekspresije in izolacije rekombinantne kaspaze-1 po dveh protokolih. Pri prvem poskusu po čiščenju proteina s preparativnim kromatografskim sistemom ÄKTA prisotnosti proteina v izbranih frakcijah s specifičnimi protitelesi z metodo prenosa western nismo potrdili. Pri drugem in tretjem poskusu kljub različnim pristopom k optimizaciji postopka zaradi težav z obarjanjem proteina nismo uspeli pridobiti topne in encimsko aktivne kaspaze-1. Zaradi neuspešne izolacije smo za vrednotenje zaviralcev uporabili komercialno dostopen rekombinantni encim. Referenčni zaviralec NSC697923 je izkazal zaviralno delovanje v nanomolarnem območju, medtem ko je spojina KEM-31A, sintetizirana na Fakulteti za farmacijo, zavirala kaspazo-1 v nizkem mikromolarnem območju. Spojina KEM-31A izkazuje obetavno zaviralno delovanje in predstavlja primerno izhodiščno spojino za nadaljnjo optimizacijo potencialnih zaviralcev kaspaze-1. Poleg tega smo pripravili osnovo za nadaljnjo optimizacijo postopka priprave rekombinantne človeške kaspaze-1.20262026-11-07 08:45:07Magistrsko delo/naloga190924VisID: 138523sl