Egerolizini kot označevalci zgodnje apoptoze in kot teranostiki v raziskavah raka sečnega mehurjaŽeželj, Luka (Avtor) Sepčić, Kristina (Mentor) Resnik , Nataša (Komentor) apoptozabiooznačevalciegerolizinikardiolipinlipidne domenesfingomielinteranostikaurotelijski rakNatančna prepoznava specifičnih lipidov in lipidnih domen na plazmalemi je ključna za razumevanje celičnih procesov ter za razvoj novih diagnostičnih in terapevtskih orodij v celični biologiji in onkologiji. Proteini egerolizinske družine zaradi svoje edinstvene sposobnosti prepoznavanja specifičnih lipidov in lipidnih mikrodomen ponujajo izjemen biomedicinski potencial, ki pa doslej na in vitro modelih sesalskih celic še ni bil celovito ovrednoten. Namen doktorske disertacije je bil preučiti rekombinantne egerolizine erilizin A (EryA), ostreolizin A6 (OlyA6) in njegov enotočkovni mutant E69A ter njuna proteinska partnerja z domeno kompleksa, ki napade membrano (ang. membrane-attack complex/perforin; MACPF) pleurotolizin B (PlyB) in pulmolizin B (PulB). Naš cilj je bil ovrednotiti te proteine kot inovativne biooznačevalce za detekcijo apoptoze in kot terapevtske komplekse za selektivno uničevanje urotelijskih rakavih celic. EryA odlikuje specifična afiniteta do kardiolipina (CL), pri čemer izstopa kot edini znan egerolizin, ki se ne veže na sfingomielin. Z uporabo površinske plazmonske resonance smo dokazali, da se EryA-mCherry z visoko specifičnostjo in ireverzibilno veže na CL v umetnih membranskih sistemih. Fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da EryA-mCherry označi CL na plazmalemi in membranskih brstih apoptotskih epitelijskih celic MDCK in RT4. S tem je bistveno presegel omejitve standardnega, a v našem delu dokazano nespecifičnega označevalca apoptoze aneksina V-FITC. S tem smo dokazali, da EryA-mCherry predstavlja nov, visoko specifičen in ireverzibilen označevalec apoptoze. V nadaljevanju smo raziskali diagnostični potencial fluorescenčno označenih proteinov OlyA6 z afiniteto do lipidnih domen sfingomielin/holesterol in mutanta E69A z afiniteto do s holesterolom vezanega in prostega sfingomielina na celičnih modelih urotelijskega raka. Ugotovili smo, da se proteina selektivno vežeta na linijo normalnih imortaliziranih urotelijskih celic (SV-HUC-1) in na liniji urotelijskih rakavih celic (RT4, T24), medtem ko se na normalne primarne prašičje urotelijske celice (NPU) ne vežeta. Te razlike v vezavi neposredno sovpadajo s prisotnostjo uroplakinov; zmanjšano ali povsem odsotno izražanje uroplakinov pri linijah rakavih in normalnih celic omogoči dostop egerolizinov do tarčnih lipidnih domen na plazmalemi. Poleg strukturne dostopnosti pa na vezavo egerolizinov pomembno vpliva tudi lipidna sestava plazmaleme, saj imajo rakave celice povečano vsebnost holesterola in membranskih raftov. Zaradi mutacije ima E69A bistveno višjo afiniteto do membranskih raftov, kar omogoča njegovo močnejšo vezavo na celice brez uroplakinov. Terapevtski potencial citolitičnih kompleksov egerolizinov in proteinskih partnerjev z domeno MACPF smo ovrednotili z analizo njihove citotoksične aktivnosti. Kompleksa OlyA6/PlyB in E69A/PlyB sta bila visoko učinkovita pri selektivnem odstranjevanju rakavih celic, medtem ko na normalne celice NPU nista imela učinka. Izkazalo se je, da je kompleks OlyA6/PlyB najbolj primeren za ciljano delovanje na neinvazivne rakave celice RT4, kompleks E69A/PlyB pa je bil učinkovitejši pri odstranitvi invazivnih rakavih celic T24. Primerjava proteinskih partnerjev z domeno MACPF je potrdila izrazito prednost uporabe proteina PlyB v citolitičnih kompleksih v primerjavi s proteinom PulB, saj so bili kompleksi egerolizinov s proteinskim partnerjem PulB pri enakih koncentracijah manj učinkoviti na vseh testiranih celičnih linijah. Z večparametrskim testom smo potrdili, da je mehanizem celične smrti, ki ga povzročijo kompleksi, nekroza, ki nastopi zaradi tvorbe transmembranskih por, porušenja membranskega potenciala in osmotskega ravnovesja. Pridobljeni rezultati dokazujejo, da fluorescenčno označeni egerolizini predstavljajo visoko selektivna diagnostična orodja za detekcijo apoptoze (EryA-mCherry) in za prepoznavo urotelijskih rakavih celic (OlyA6-mCherry in E69A-mCherry). Kombinacija rekombinantnih egerolizinov OlyA6 ali E69A s porotvornim partnerjem PlyB pa zaradi specifičnega prepoznavanja lipidne sestave membran omogoča nekrotsko lizo urotelijskih rakavih celic, s čimer predstavlja obetavno in inovativno strategijo za tarčno uničevanje rakavih urotelijskih celic.20262026-10-24 07:16:11Doktorsko delo/naloga190193VisID: 43489sl