Klinična uporabnost metagenomskega sekvenciranja pri bolnikih z vročinsko boleznijoSlunečko, Jan (Avtor) Korva, Miša (Mentor) Bogovič , Petra (Komentor) metagenomsko sekvenciranje (mNGS)vročinska bolezen brez lokalizacijerazvoj protokola mNGSklinična uporaba mNGSNamen Namen doktorske disertacije je bil raziskati klinično uporabnost metagenomskega sekvenciranja (mNGS) pri diagnostiki bolnikov z vročinsko boleznijo brez lokalizacije v Sloveniji. Preučili smo, v kolikšni meri mNGS omogoča prepoznavo povzročitelja bolezni v akutni fazi, ter pripravili protokole za vključitev mNGS v klinično diagnostiko. Za ta namen smo razvili celovit protokol mNGS in ter določili metriko za standardizirano poročanje rezultatov mNGS. Hipoteze (H1) Z metagenomskim sekvenciranjem bomo povzročitelja ugotovili pri 60–80 % bolnikov s predhodno mikrobiološko ugotovljenim vzrokom vročinske bolezni brez prepričljivih znakov prizadetosti posameznih organov. (H2) Z metagenomskim sekvenciranjem bomo pri bolnikih z etiološko nepojasnjeno vročinsko boleznijo brez prepričljivih znakov prizadetosti posameznih organov ugotovili povzročitelja pri 15–25 % primerov. (H3) Z metagenomskim sekvenciranjem bomo ugotovili porajajoče se virusne povzročitelje vročinske bolezni, ki se kaže brez prepričljivih znakov prizadetosti posameznih organov v Sloveniji. (H4) Razvili bomo bolj celosten delotok za metagenomski pristop sekvenciranja, s katerim bomo učinkovito ugotavljali tudi okužbe z virusi z RNK genomom. Metode V doktorsko disertacijo smo vključili shranjene vzorce polne krvi, pridobljene od 462 bolnikov. Za sekvenciranje smo uporabili tehnologijo kratkih odčitkov in tehnologijo dolgih odčitkov. Doktorska disertacija je sestavljena iz treh delov. V prvem delu doktorske disertacije smo preverjali vpliv modifikacij posameznih korakov priprave vzorca na končni rezultat sekvenciranja in analizo podatkov. V drugem delu doktorske disertacije smo optimizirani protokol evalvirali s testiranjem kliničnih vzorcev bolnikov, pri katerih smo v akutnem vzorcu krvi z uveljavljenimi molekularnimi metodami predhodno dokazali povzročitelja. V tretjem delu doktorske disertacije smo evalvirani protokol mNGS uporabili za iskanje mikroorganizmov v vzorcih krvi bolnikov z vročinsko boleznijo brez lokalizacije, pri katerih z rutinskimi diagnostičnimi pristopi etiologija ni bila ugotovljena. Rezultati Glede na posamezne rezultate prvega dela doktorske smo razvili inovativen pristop sekvenciranja vzorcev krvi bolnikov z akutno vročinsko boleznijo brez lokalizacije, ki omogoča dokaz tako znotrajceličnih kot tudi zunajceličnih mikroorganizmov z DNK in RNK genomom. S tem pristopom ohranimo zaznavanje patogenov z DNK genomom, hkrati pa ojačamo količino RNK in zmanjšamo količino gostiteljske NK. Razviti protokol kombinira s SISPA-A pripravljen izolat NK iz polne krvi s SISPA-B pripravljenim izolatom NK iz plazme, ki je dodatno predobdelan z DNazo in kompletom reagentov QIAseq FastSelect -rRNA/Globin. V drugi del doktorske disertacije smo vključili 200 bolnikov. Med njimi je bilo 97 okužb s patogeni z DNK genomom in 103 okužb s patogeni z RNK genomom. Po etiologiji je bilo 79 bakterijskih, 3 parazitske in 118 virusnih okužb. Med virusnimi povzročitelji je bilo 15 vzorcev z virusi z DNK genomom in 103 vzorcev z virusi z RNK genomom. Z ročnim pregledom rezultatov sekvenciranja smo v vzorcih, v katerih smo z molekularnimi metodami potrdili povzročitelja, z mNGS istega povzročitelja dokazali v 79,5 % primerov (159/200). Primerjava rezultatov orodja ClinSeq z ročno analizo je pokazala 83,5-odstotno splošno ujemanje (OPA), 79,2 -odstotno ujemanje pri pozitivnih (PPA) in 100-odstotno ujemanje pri negativnih (NPA). Vrednost κ (Cohenov faktor kappa) je bil 0,61, kar kaže na znatno usklajenost med metodama. V zadnjem delu doktorske disertacije smo analizirali vzorce 262 bolnikov. Pri 53 bolnikih s serološko potrjeno etiologijo smo z mNGS povzročitelja v akutnem vzorcu dokazali v 5,7 % primerov (3/53). Med 209 bolniki z vročinsko boleznijo brez lokalizacije smo etiologijo opredelili v 11,0 % primerov (23/209), pri 2,4 % (5/209) ugotovili možnega povzročitelja, medtem ko je 86,6 % (181/209) primerov ostalo nepojasnjenih. Z mNGS smo prvič dokazali tudi okužbe z bakterijama Borrelia miyamotoi in Spiroplasma ixodetis. Zaključki Razviti mNGS delotok omogoča zanesljivo odkrivanje širokega spektra patogenov, vključno z nekultivabilnimi bakterijami, virusi in paraziti. Združevanje vzorcev plazme in polne krvi pred pripravo knjižnic izboljša detekcijo, poenostavi obdelavo, zmanjša stroške in omogoča prilagodljive možnosti sekvenciranja. Uvedba matematične metode razvrščanja dodatno izboljša interpretacijo rezultatov. Ti izsledki predstavljajo prve dokazane primere okužb z B. miyamotoi in S. ixodetis v Sloveniji ter nudijo podlago za vključitev mNGS v razširjeno mikrobiološko diagnostiko. Prihodnje raziskave se bodo osredotočile na validacijo protokola na dodatnih vrstah vzorcev, primerjavo z drugimi metodami in optimizacijo analitičnih pristopov za klinično uporabnost. Sklepi (1) Pri bolnikih z vročinsko boleznijo brez lokalizacije je občutljivost mNGS 79,5 %. (2) Z mNGS smo pri bolnikih z etiološko nepojasnjeno vročinsko boleznijo brez lokalizacije ugotovili povzročitelja pri dodatnih 11,0 % primerov. (3) Z mNGS smo potrdili prve primere okužb z B. miyamotoi in S. ixodetis v Sloveniji. (4) Z mNGS smo pri bolniku s hemoragično mrzlico z renalnim sindromom dodatno ugotovili sočasno okužbo z Neoehrlichia mikurensis. (5) Razvili smo celovit protokol za metagenomsko sekvenciranje vzorcev krvi bolnikov z vročinsko boleznijo brez lokalizacije.(6) Razvili smo standardiziran bioinformacijski protokol MetaAll in orodje ClinSeq, ki sta prosto dostopna za vse raziskovalce in omogočata učinkovito odkrivanje patogenov v kliničnih vzorcih. (7) Z razvojem orodja »ClinSeq« smo standardizirali poročanje metagenomskih rezultatov in opredelili merila za interpretacijo mNGS.20262026-10-21 08:00:20Doktorsko delo/naloga190041VisID: 43441sl