Strukturne in funkcijske raziskave večopravilnih proteinov CP in HCPro iz rastlinskih virusov rodu PotyvirusKoritnik, Neža (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) PotyvirusCPHCProkrio-EMmolekulske interakcijePotivirusi (rod Potyvirus, družina Potyviridae) so ssRNA-virusi, ki z okužbo kulturnih rastlin povzročajo obsežno gospodarsko škodo. Njihov majhen genom kodira 11 proteinov, med katerimi je plaščni protein (CP) edini strukturni protein, ki sodeluje v več fazah okužbe. Med rastlinami se virioni prenašajo z listnimi ušmi, kjer ima ključno vlogo interakcija CP s potivirusno pomožno komponento proteinazo (HCPro), večopravilnim proteinom s proteazno aktivnostjo in vlogo pri zaviranju gostiteljskega RNA-utišanja. Cilj doktorske naloge je bila karakterizacija molekulskih interakcij HCPro s CP in siRNA na biokemijski, biofizikalni in strukturni ravni. Kot modela smo uporabili virus A krompirja (PVA) in virus Y krompirja (PVY). Ker PVA še ni bil strukturno okarakteriziran, smo najprej s krio-EM smo določili strukturo virusa in njegovih virusu podobnih delcev (VLP-jev). Pokazali smo, da je osnovna arhitektura PVA podobna tisti od PVY, vendar vsebuje majhne razlike, ki omogočajo vrstno specifične interakcije CP–CP in CP–RNA. Te razlike se odražajo tudi v sestavljanju VLP-jev - rekombinantni PVACP v bakterijah tvori dva tipa VLP-jev z levosučno vijačno simetrijo: filamente z RNA (strukturno podobne virionom) in brez RNA, pri čemer se slednji izrazito razlikujejo od VLP-jev brez RNA, ki jih tvori PVYCP. Na osnovi strukturne analize in mutageneze smo identificirali aminokislinske ostanke na interakcijskih površinah CP–CP in CP–RNA, ki so ključni za variabilnost VLP-jev. Njihovo vlogo smo dodatno potrdili s strukturno analizo VLP-jev virusa jedkanja tobaka (TEV), virusa lisavosti paprike (PepMoV) in virusa mozaika divjega sirka (JGMV), s katerimi smo tudi dodatno pokazali vrstno specifičnost arhitektur VLP-jev brez RNA. Z izražanjem v bakterijah smo pripravili PVAHCPro in PVYHCPro z N-končnim fuzijskim partnerjem maltozo vezavnim proteinom (MBP). Oba proteina sta nagnjena k agregaciji ter tvorita več homo-oligomernih zvrsti. Pokazali smo interakcijo PVAHCPro in PVYHCPro s PVACP in PVYCP (v obliki VLP-jev in monomera) znotraj potivirusne vrste in med vrstama. Pokazali smo tudi, da PVAHCPro in PVYHCPro vežeta siRNA neodvisno od nukleotidnega zaporedja. Pri specifičnih pogojih MBP-PVAHCPro (ne pa MBP- PVYHCPro) tvori filamente zaradi polimerizacije PVAHCPro. To omogoča strukturno stabilizacijo PVAHCPro in določanje njegove krio-EM strukture. Določili smo približno 60 % strukture - tri odseke polpeptidne verige, ki tvorijo osrednjo in C-končno domeno. Interakcijske površine med proteini PVAHCPro v filamentih bi lahko bile pomembne tudi pri oligomerizaciji potivirusnih HCPro v naravi. Naše delo pokaže, da majhne, vrstno specifične razlike v potivirusnih CP usmerjajo specifične interakcije v virionih in VLP-jih, ki verjetno uravnavajo sestavljanje stabilnih virionov. Hkrati to delo razširja razumevanje strukturnih značilnosti HCPro in njegove oligomerizacije ter predstavlja osnovo za razumevanje interakcij HCPro s CP in siRNA. Delo predstavlja osnovo za nadaljnje raziskave v rastlinskem kontekstu.20262026-10-21 07:15:12Doktorsko delo/naloga190031VisID: 43416sl