​Izolacija in lastnosti proteinov iz strupa modrasa (Vipera ammodytes ammodytes), ki povzročajo prehodno in reverzibilno trombocitopenijo funkcionalnih trombocitovDobaja Borak, Mojca (Avtor) Brvar, Miran (Mentor) Križaj, Igor (Komentor) Modraskačji strupreverzibilna trombocitopenijaVaa-snaclec-3/2antitrombotikUvod: V Centru za klinično toksikologijo in farmakologijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana letno zdravimo 5–10 bolnikov po ugrizu modrasa (Vipera ammodytes ammodytes; Vaa). Pri bolnikih po ugrizu modrasa smo večkrat opazili pojav izrazite, vendar prehodne trombocitopenije brez klinično pomembne krvavitve. Mehanizem tega procesa še ni bil pojasnjen. Namen: Namen doktorske disertacije je bil raziskati mehanizem trombocitopenije po zastrupitvi z modrasovim strupom. Metode: Doktorsko disertacijo smo razdelili na klinične, biokemijske, ex vivo in in vivo raziskave. V kliničnem delu raziskave smo pri bolnikih po ugrizu modrasa analizirali pogostost pojava trombocitopenije, z njo povezano klinično sliko ter lastnosti trombocitov med trombocitopenijo in po njeni razrešitvi. Ocenili smo tudi vpliv različnih vrst protistrupa na potek in resnost trombocitopenije. V biokemijskem delu raziskave smo iz modrasovega strupa izolirali več proteinov snaclec, jih strukturno in funkcijsko opredelili ter z ex vivo poskusi preučili njihove učinke na trombocite. Na podlagi pregleda literature smo namreč sklepali, da utegnejo snacleci pomembno prispevati k razvoju trombocitopenije. V sklepnem delu raziskave smo učinke izbranega snacleca, Vaa-snaclec-3/2, opredelili v in vivo modelu ter preverili njegov antitrombotični potencial. Rezultati: V kliničnem delu disertacije smo pokazali, da se trombocitopenija po ugrizu modrasa pojavlja pogosteje kot po ugrizu gada, kar je najverjetneje posledica razlike v sestavi strupa obeh vrst kač. Trombocitopenija je bila prehodna in reverzibilna po aplikaciji protistrupa ter neposredno odvisna od koncentracije prostega strupa v krvi, kar potrjuje ključno vlogo strupnih komponent pri njenem nastanku. Zvišanje števila trombocitov po intravenski aplikaciji protistrupa je sovpadalo z znižanjem koncentracije strupa v obtoku. Kljub hudi trombocitopeniji so trombociti pri prizadetih bolnikih ohranili polno funkcionalnost. Rotacijska tromboelastometrija je po ponovni normalizaciji števila trombocitov podala rezultate v mejah referenčnih vrednosti. To kaže na ohranitev polne funkcionalnosti hemostaze, v skladu z rezultati agregometrije. Rezultati pretočne citometrije so pokazali, da med trombocitopenijo in po njej ni prišlo do povečane izpostavljenosti P-selektina na zunanji membrani trombocitov, ki sicer označuje njihovo aktivacijo. Naši izsledki kažejo, da trombocitopenija ni posledica agregacije trombocitov, temveč bolj verjetno njihove aglutinacije brez aktivacije. V biokemijskem delu disertacije smo izolirali več snaclecev iz modrasovega strupa, pri čemer je le heterodimerni snaclec Vaa-snaclec-3/2 brez vpliva na koagulacijske teste specifično zaviral z ristocetinom-inducirano aglutinacijo trombocitov. Ex vivo je dodatek Vaa-snacleca-3/2 polni krvi povzročil izrazito trombocitopenijo. Pod mikroskopom smo pri tem opazili tvorbo skupkov (aglutinatov) manjšega števila trombocitov. Pokazali smo, da se Vaa-snaclec-3/2 koncentracijsko-odvisno veže na trombocitni receptor GPIb, ne pa na receptorje GPIIb/IIIa, GPIX ali GPVI, pri tem pa ne sproži aktivacije trombocitov. V in vivo modelu tromboze karotidne arterije pri miši je Vaa-snaclec-3/2 izval izrazito, a prehodno trombocitopenijo, š čimer je zavrl nastanek tromba ob poškodbi žilne stene. Aplikacija fragmentov F(ab’)₂ protiteles, usmerjenih proti modrasovemu strupu, je trombocitopenijo učinkovito odpravila. Klinični primer bolnice s ponavljajočimi se epizodami trombocitopenije po ugizu modrasa in aplikacijami fragmentov Fab protistrupa je dodatno potrdil, da je trombocitopenija odvisna od koncentracije strupa. Potrdil je tudi reverzibilnost trombocitopenije ob uporabi imunoterapije, ki ohrani tudi popolno funkcionalnost trombocitov. Zaključek: Izrazita trombocitopenija je pogost pojav ob zastrupitvi z modrasovim strupom. Zaplet je ob aplikaciji fragmentov Fab ali F(ab’)₂, usmerjenih proti celotnemu strupu modrasa, hitro razrešljiv, trombociti pa ostanejo funkcionalni. Med več snacleci v strupu modrasa le Vaa-snaclec-3/2 povzroči trombocitopenijo. Vzrok za to je vezava Vaa-snaclec-3/2 na trombocitni receptor GIb, ki izove aglutinacijo trombocitov brez njihove aktivacije. V disertaciji smo celostno pojasnili mehanizem trombocitopenije pri zastrupitvi z modrasovim strupom. Komponento strupa Vaa-snaclec-3/2 smo identificirali kot ključni molekulski dejavnik opazovanega procesa in s tem izpostavili njegov velik terapevtski potencial pri medicinskih postopkih, kjer je potreben prehoden in hitro razrešljiv antitrombotičen učinek.20262026-10-16 13:31:12Doktorsko delo/naloga189829VisID: 43331sl