Identifikacija T4 vezavnih proteinov v navadnem repnjakovcuKolar, Alliana (Avtor) Taler-Verčič, Ajda (Mentor) Arabidopsis thalianatiroksinT4-vezavni proteinimolekulsko sidranjerekombinantni proteiniJod je v rastlinah prisoten v anorganskih in organskih oblikah ter lahko vpliva na različne fiziološke procese, kot so rast, odziv na stres, antioksidativna aktivnost in metabolizem. V rastlinskih tkivih so bili identificirani tudi jodirani metaboliti, med njimi spojine, povezane s tiroksinom (T4) in trijodtironinom (T3), vendar njihova fiziološka vloga v rastlinah še ni pojasnjena. Namen magistrskega dela je bil identificirati potencialne T4 vezavne proteine v navadnem repnjakovcu (Arabidopsis thaliana) in silico ter izbrane kandidate pripraviti za eksperimentalno preučevanje njihovega odziva na T4 oziroma T3. Kandidate smo najprej identificirali z bioinformacijskim pristopom. Na podlagi napovedanih proteinskih struktur iz podatkovne zbirke AlphaFold smo izvedli molekulsko sidranje liganda T4 z orodjem AutoDock Vina. Z dvostopenjskim filtriranjem glede na napovedano vezavno energijo in vrednosti RMSD smo izbrali štiri potencialne T4-vezavne proteine: VSP3, ICME, ACX3 in At4g31350. Analiza napovedanih vezavnih mest je pokazala, da se T4 v izbranih proteinih predvidoma stabilizira s kombinacijo hidrofobnih oziroma aromatskih ter polarnih ali elektrostatskih interakcij. Za izbrane kandidate smo iz plazmidnih vektorjev s cDNA želenih kodirajočih zaporedij pripravili različne rekombinantne konstrukte, jih vstavili v ekspresijski vektor pET 32b(+) ter izrazili v bakteriji Escherichia coli. Uspešno smo izolirali rekombinantna proteina VSP3_1 in VSP3_2 ter v manjši meri ACX3, medtem ko izolacija ICME_3 in At4g31350_1 ni omogočila nadaljnjih analiz zaradi nezadostne kakovosti oziroma količine. Z metodo dinamičnega sipanja svetlobe smo ugotovili, da sta bila vzorca s proteinoma VSP3_1 in VSP3_2 razmeroma homogena, medtem ko je bilo v vzorcu s proteinom ACX3 prisotnih več agregatov in nečistoč. Z nanodiferenčno vrstično fluorimetrijo smo določili termično stabilnost proteinov VSP3_1 in VSP3_2 v prisotnosti T4, vendar spremembe temperature tališča niso pokazale koncentracijsko odvisne stabilizacije ali destabilizacije. Povečane stabilizacije proteinov ob prisotnosti T4 zato ni bilo mogoče zanesljivo potrditi ali izključiti. Analiza interakcije rekombinantnih proteinov ACX3, VSP3_1 in VSP3_2 s fluorescenčno označenim T3 z nativno PAGE prav tako ni omogočila jasnega zaključka zaradi nizke ločljivosti in šuma. Rezultati eksperimentalnih analiz niso omogočili zanesljive potrditve stabilizacije izbranih rekombinantnih proteinov v prisotnosti T4 oziroma interakcije proteinov s T3. Zato napovedi molekulskega sidranja ni mogoče neposredno povezati z dejansko vezavo ligandov. Za nadaljnje preverjanje potencialnih interakcij bodo potrebni čistejši proteinski vzorci, optimizirani eksperimentalni pogoji in dodatne biofizikalne metode.20262026-09-30 12:45:04Magistrsko delo/naloga188957VisID: 25577sl