Opazovnaje mobilnosti stresnih granul s pomočjo optične pincete v stabilni celični liniji FlpIn SHSY-5Y-Halo-G3BPNograšek, Teo (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) stresne granuleoptična pincetamobilnostG3BP1Stresne granule se tvorijo v celicah za omilitev posledic zunanjih stresnih dejavnikov. Nastanejo iz komponent zaustavljene translacije, vsebujejo RNA vezavne proteine (RBP), RNA in ribosome. G3BP1 je eden od ključnih proteinov stresnih granul in ima ključno vlogo pri njihovi tvorbi. Kondenzacija je tako intenzivna, da pride do fazne ločitve dveh tekočin (LLPS). Strukture, nastale prek LLPS, imajo lastnosti tekočinskih kapljic: so sferične, imajo ločeno sestavo ter se manjše kapljice lahko zlivajo in združujejo v večje kapljice. Visoka koncentracija molekul in sferična oblika predstavljata odlično tarčo za manipulacijo z optično pinceto. Optična pinceta temelji na intenzivnem snopu svetlobe (laser), ki lahko ujame sferične strukture z visokim relativnim lomnim količnikom. Podobne lastnosti imajo stresne granule, saj imajo višjo koncentracijo od citoplazme. Na podlagi tega dejstva smo začrtali temelje tega dela. Izbrali smo celično linijo SH-SY5Y, v katero smo prek transfekcije vnesli konstrukt za izražanje rekombinantnega proteina HaloTag-G3BP1. Oznaka HaloTag nam omogoči kovalentno vezavo stabilnega sintetičnega fluorfora na protein G3BP1. Z dodatkom natrijevega arzenita (NaAsO2) smo v celicah sprožili oksidativni stres, ki je induciral tvorbo stresnih granul. Rekombinantni protein je pokazal podobno kondenzacijo in lokalizacijo kot endogeni G3BP1 pod stresnimi pogoji. Izbrani HaloTag ligand Oregon Green je uspešno prešel v sestavljene stresne granule, kar nam je omogočilo nadaljnje spremljanje granul pod optično pinceto. S pinceto smo testirali 2928 granul. Okoli 5 % (156) granul se je ob približanju laserskega žarka optične pincete premaknilo. Večina uspešno premaknjenih granul se ob približanju laserskega žarka premaknilo proti žarku. Približno 31 % uspešno premaknjenih granul pa se je od laserskega žarka odmaknilo. 10 granul se je popolnoma ujelo v optično past laserskega žarka, kar nam je omogočilo popoln nadzor nad premikanjem granule. Opazili smo, da večja kot je bila granula, bolj dovzetna je bila na manipulacijo z optično pinceto. Večje granule so bolj dozorene in koncentrirane, kar pomeni, da imajo višji relativni lomni količnik. Skozi delo smo uspešno uporabili optično pinceto za manipulacijo in ujetje stresnih granul, kar ponuja pot za nadaljnje eksperimente, ki se fokusirajo na bolj fizikalne lastnosti stresnih granul pod različnimi pogoji.20262026-09-29 12:00:04Magistrsko delo/naloga188848VisID: 22778sl