Priprava in selekcija knjižnice afiteles z namenom prekinitve homodimerizacije proteaze MProOven, Eva (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) afitelesaMProhomodimerizacijaLexA sistemproteinske interakcijeGlavna proteaza virusa SARS-CoV-2 (MPro) ima ključno vlogo pri replikaciji virusa, saj je nujna za procesiranje virusnih poliproteinov. Njena encimska aktivnost je odvisna od tvorbe dimera, kar odpira možnost alternativnega terapevtskega pristopa, ki temelji na zaviranju dimerizacije namesto neposrednega ciljanja katalitičnega mesta encima. Cilj magistrskega dela je bil pripraviti knjižnico različnih variant afiteles in med njimi najti afitelo, sposobno prekinitve homodimerizacije proteaze MPro. Uspešnost prekinitve smo detektirali v bakterijskem sistemu Escherichia coli za detekcijo homodimerizacije proteinov. V ta namen je bil obstoječi sistem LexGFP nadgrajen v sistem LexKan, pri katerem je prekinitev homodimerizacije povezana z izražanjem odpornosti na kanamicin. Sistem omogoča selekcijo bakterij, v katerih je prišlo do prekinitve dimerizacije proteaze MPro s pripravljenimi afitelesi. S kloniranjem po Gibsonu smo pripravili ustrezne plazmidne konstrukte in uspešno vzpostavili izboljšan sistem za detekcijo homodimerizacije LexKan. Z dvema zaporednima kloniranjema po Gibsonu smo pripravili plazmid pAFI, ki vsebuje zaporedje afitelesa in selekcijski marker za odpornost proti kloramfenikolu. Plazmid je služil kot matrica za pripravo knjižnice afiteles, ki smo jo pripravili z uporabo degeneriranih podaljšanih oligonukleotidov. Afitelesa so tako vsebovala naključne mutacije na značilnih aminokislinskih mestih vezavne površine. Selekcijo knjižnice smo izvedli s sistemom LexKan. Negativna kontrola v sistemu LexKan je potrdila, da je mogoče zaznati homodimerizacijo proteinskih tarč v bakterijskem okolju. Čeprav v okviru te naloge nismo identificirali afitelesa, ki bi učinkovito prekinilo dimerizacijo MPro, smo pokazali, da je priprava knjižnice afiteles z degeneriranimi podaljšanimi oligonukleotidi izvedljiva. Hkrati smo identificirali več možnih izboljšav, ki bi jih bilo treba uvesti za uspešno selekcijo. Predpostavljamo da ima sistem LexKan, ki temelji na himerah transkripcijskih faktorjev LexA, potencialno širšo uporabnost pri preučevanju proteinskih interakcij ter pri razvoju novih terapevtskih strategij, usmerjenih v zaviranje dimerizacije tarčnih proteinov.20262026-09-23 12:50:01Magistrsko delo/naloga188484VisID: 24265sl