Načrtovanje in razvoj rekombinantnega nitastega bakteriofaga kot funkcionalne alternative protitelesom v encimskoimunskem testuMertelj, Janja (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Gnidovec, Klemen (Komentor) rekombinantni nitasti bakteriofagencimskoimunski testmimetiki protitelesbetalaktamazadetekcija antigenovImunokemijski testi predstavljajo pomembno analitsko orodje v diagnostiki in raziskavah. Ker je priprava protiteles pogosto dolgotrajna in draga, obstaja potreba po razvoju alternativnih detekcijskih sistemov. V okviru magistrske naloge smo zato razvili modularno detekcijsko sondo na osnovi rekombinantnega nitastega bakteriofaga kot alternativo protitelesom v encimskoimunskem testu. Na površini nitastega bakteriofaga smo s pomočjo hibridnega bakteriofagnega vektorja f88KE, ki omogoča dvojno predstavitev, predstavili peptida SpyTag in SnoopTag. Kot reportersko komponento sistema smo pripravili fuzijski protein SpyCatcher-betalaktamaza, sestavljen iz proteinskega partnerja SpyCatcher in reporterskega encima betalaktamaze. Vezavno komponento sistema pa so predstavljali različni fuzijski proteini (vezavni protein-SnoopCatcher-ji), sestavljeni iz različnih mimetikov protiteles in proteinskega partnerja SnoopCatcher. Fuzijske proteine smo izrazili v bakterijah Escherichia coli, jih izolirali in očistili s kromatografskimi metodami. Uspešnost priprave fuzijskih proteinov in njihovo konjugacijo na rekombinantne nitaste bakteriofage smo ovrednotili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata in prenosom western. Delovanje razvitega sistema smo preizkusili pri detekciji modelnega antigena in vnetnih citokinov v formatu modificiranega fagnega encimskoimunskega testa in v sendvič obliki encimskoimunskega testa. Vse načrtovane fuzijske proteine smo uspešno izrazili, izolirali in očistili ter jih s pomočjo dveh ortogonalnih sistemov Catcher/Tag uspešno konjugirali na površino rekombinantnih nitastih bakteriofagov. Dvojno konjugirani bakteriofagi so se specifično vezali na tarče in omogočili nastanek merljivega signala. Pri primerjavi z uveljavljenimi imunokemijskimi pristopi pa se je izkazalo, da je občutljivost razvitega sistema približno tri velikostne rede nižja od občutljivosti klasičnega encimskoimunskega testa. Razvita detekcijska sonda vseeno predstavlja obetavno modularno platformo za zaznavanje različnih bioloških molekul. Rezultati potrjujejo možnost uporabe rekombinantnih nitastih bakteriofagov kot funkcionalnih alternativ protitelesom, nadaljnja optimizacija reporterskega sistema in pogojev detekcije pa bi lahko izboljšala občutljivost ter razširila uporabnost razvite platforme v analitskih, raziskovalnih in diagnostičnih aplikacijah.[J. Mertelj]20262026-09-15 08:45:53Magistrsko delo/naloga187815UDK: 57.083.3(043.2)VisID: 128886COBISS_ID: 291427587sl