Identifikacija hidrolaz gostiteljskih celic in optimizacija njihovega odstranjevanja v proizvodnji terapevtskih protitelesŠprager, Ernest (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) proteini gostiteljskih celichidrolazemonoklonska protitelesapolisorbatiacil-protein tioesteraza 1profiliranje proteinov na osnovi aktivnostimasna spektrometrijazaključni procesiTerapevtska monoklonska protitelesa (mAb) predstavljajo večino bioloških učinkovin. Praviloma jih pridobivamo s tehnologijo rekombinantne DNA z izražanjem v celicah ovarija kitajskega hrčka. Osrednjo skupino procesnih nečistot predstavljajo proteini, ki jih sproščajo gostiteljske celice (t.i. proteini gostiteljskih celic; angl. host cell proteins, HCP). Mednje sodijo tudi hidrolaze, ki lahko razgrajujejo pomožne snovi, kot so polisorbati, kar zmanjšuje stabilnost formulacije, skrajšuje rok uporabnosti izdelka in ogroža njegovo kakovost ter varnost. To doktorsko delo odpravlja vrzeli pri zaznavanju in odstranjevanju nizko zastopanih encimsko aktivnih HCP z na aktivnosti osredotočenim pristopom, ki povezuje profiliranje proteinov na osnovi aktivnosti, preučevanje interakcij HCP–mAb, tarčno proteomiko, encimske teste in racionalno zasnovo procesov izolacije in čiščenja učinkovine. Pokazali smo, da encimsko katalizirano razgradnjo polisorbatov v formulaciji mAb lahko pripišemo specifičnim hidrolazam iz skupine HCP. S pomočjo z biotinom označene sonde, ki je vsebovala reaktivno fluorofosfonatno skupino, in masne spektrometrije smo identificirali acil‑protein tioesterazo 1 (APT1) kot nov HCP, sposoben razgradnje polisorbatov. Na vpletenost APT1 v hidrolizo polisorbatov nakazuje več dokazov: (i) korelacija med ravnjo APT1 in hitrostjo razgradnje polisorbata v formulaciji mAb, (ii) ujemanje razgradnega profila polisorbata s tistim, ki smo ga zaznali za rekombinantni encim APT1, in (iii) zaščita pred razgradnjo polisorbatov ob dodatku selektivnih zaviralcev APT1 ML348 in ML211. Na primeru APT1 smo pokazali, da lahko zadrževanje kritičnih HCP izvira iz specifičnih asociacij med njimi in mAb. Med kromatografijo z ločevanjem po velikosti se APT1 eluira sočasno z monomerno frakcijo mAb, medtem ko smo z bioslojno interferometrijo potrdili specifično interakcijo APT1 s prvo konstantno domeno težke verige (CH1) protitelesa. Pokazali smo tudi, da lahko z uvedbo alternativnih kromatografskih tehnik in optimizacijo kromatografskih pogojev izboljšamo odstranjevanje produktu škodljivih HCP. V pretočnem načinu anionske izmenjevalne kromatografije sta membranska adsorberja izkazala učinkovitejše odstranjevanje vseh HCP v primerjavi z delčnim nosilcem. Pokazali smo, da pH in prevodnost tekočine nanosa ter količina nanosa mAb na kromatografski nosilec močno vplivajo na odstranjevanje hidrolaz. Ugotovili smo, da celokupna količina HCP ni nujno povezana s tveganjem za razgradnjo polisorbata in da funkcijsko usmerjeni testi pomagajo prednostno izbrati pogoje, ki smiselno zmanjšujejo encimsko aktivnost. Opisani poteki dela so široko uporabni pri zasnovi procesov izolacije in čiščenja, ki ciljajo na učinkovito odstranjevanje encimsko aktivnih HCP, in tako podpirajo proizvodnjo stabilnih, visokokakovostnih in varnih bioloških zdravil.[E. Šprager]20262026-09-13 07:15:20Doktorska disertacija187676UDK: 615.35(043.3)VisID: 41065COBISS_ID: 291368963sl