Analiza vloge gena PIEZO1 pri razvoju eritrocitozŽerovnik, Klara (Avtor) Debeljak, Nataša (Mentor) gen PIEZO1idiopatska eritrocitozaionski kanalEritrocitoza predstavlja patološko stanje, ki ga opredeljuje dolgotrajno povišana masa eritrocitov v krvnem obtoku, kar se odraža v zvišanih vrednostih hemoglobina in hematokrita. Po klasični delitvi jo glede na mesto nastanka ločimo na primarno ali sekundarno, glede na etiologijo pa na pridobljeno oziroma prirojeno. Čeprav so v ozadju večine primerov zunanji dejavniki ali spremljajoče kronične bolezni, je lahko stanje posledica tudi genetskih sprememb. Prirojene oblike, znane kot družinske eritrocitoze (ECYT), v klinični praksi diagnosticiramo z genskim testiranjem devetih genov, vključenih v regulacijo zaznavanja kisika (VHL, EGLN1, EPAS1), signalizacijo zorenja hematopoetskih celic (EPOR in EPO) oziroma prenos kisika (HBB, HBA1, HBA2, BPGM). Vzrok bolezni pri več kot 70 % bolnikov ostaja nepojasnjen, kar nakazuje na obstoj še nepoznanih genov in molekularnih mehanizmov. Med novejšimi kandidatnimi geni ima pomembno vlogo gen PIEZO1, ki kodira mehansko občutljiv ionski kanal, odgovoren za mehanotransdukcijo ter vzdrževanje hidracije, volumna in prožnosti eritrocitov. Začetni del naloge je vključeval pregled različic v literaturi ter bioinformacijsko analizo njihove lege in vpliva na funkcijo proteina. Na podlagi pridobljenih podatkov in predhodnih rezultatov sekvenciranja naslednje generacije bolnikov z idiopatsko eritrocitozo smo izbrali tri tarčne regije gena PIEZO1, ki vključujejo ekson 18, ekson 37 ter eksone 42–44, v namen potrditve prisotnosti različic PIEZO1 pri treh bolnikih. Optimizirali smo pogoje pomnoževanja odsekov z verižno reakcijo s polimerazo. Uspešnost in specifičnost pomnoževanja smo preverili z agarozno gelsko elektroforezo, očiščene produkte pa analizirali s Sangerjevim sekvenciranjem. Pri vseh treh bolnikih smo s Sangerjevim sekvenciranjem potrdili štiri različice, predhodno identificirane z metodo sekvenciranja naslednje generacije: NM_001142864.4 (PIEZO1):c.2344G>A (p.Gly782Ser) in c.2423G>A (p.Arg808Gln) v eksonu 18, c.5195C>T (p.Thr1732Met) v eksonu 37 ter c.6380C>T (p.Thr2127Met) v eksonu 44. Poleg predhodno identificiranih različic smo pri enem bolniku odkrili tudi novo sinonimno različico c.6390G>A (p.Thr2130=) v eksonu 44, ki je bila opredeljena kot benigna. Potrjene različice se nahajajo v strukturno in funkcionalno pomembnih območjih proteina PIEZO1, vključno s transmembranskima enotama in območjem sidra, ki sodelujejo pri mehanski aktivaciji, stabilizaciji in prenosu mehanskih sil.20262026-09-09 09:50:01Diplomsko delo/naloga187169VisID: 25875COBISS_ID: 302252291sl