Kloniranje in izražanje deamidacijskih mutantov proteina TDP-43 v bakteriji Escherichia coliŠkerjanc, Ariana Žana (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) TDP-43deamidacijaizražanje proteinamolekulsko kloniranjeTDP-43 je DNA- in RNA- vezavni protein, ki spada med visoko ohranjene heterogene jedrne ribonukleoproteine (hnRNP). Za nevrodegenerativni bolezni amiotrofično lateralno sklerozo (ALS) in frontotemporalno demenco (FTD) je značilno kopičenje proteina TDP-43 v obliki netopnih citoplazemskih agregatov. TDP-43 je predvsem jedrni protein, ki je sestavljen iz strukturirane N-končne domene, dveh visoko ohranjenih RNA-prepoznavnih motivov in strukturno neurejene C-končne domene, ki je nagnjena k strukturnim spremembam in razgradnji. V fizioloških pogojih ima pomembno vlogo pri regulaciji procesov metabolizma RNA. Deamidacija je reakcija, pri kateri se amidna skupina stranske verige asparagina ali glutamina odstrani in nastane aspartat oz. glutamat. Deamidacija asparagina je pogosta posttranslacijska modifikacija, ki lahko vpliva na stabilnost, topnost in funkcijo proteinov, kar bi lahko vplivalo na patološko obnašanje proteina TDP-43. V okviru eksperimentalnega dela smo pripravili vektorje z vključki, ki zapisujejo štiri različne deamidacijske mutante TDP-43. Mutacije smo uvedli z metodo kloniranja s sestavljanjem in vivo (IVA), nato pa smo rekombinantne proteine z avtoindukcijo izražali v bakterijskih celicah E. coli BL21[DE3]. Na koncu smo izražanje proteina TDP-43 pred in po indukciji preverili z NaDS-PAGE in prenosom western ter imunodetekcijo. Rezultati dela predstavljajo prvi korak k razumevanju vpliva deamidacijskih mutacij na strukturo in stabilnost proteina TDP-43, prav tako pa pripravljeni mutanti omogočajo nadaljnje študije na področju patogeneze TDP-43.20262026-09-07 12:45:00Diplomsko delo/naloga186938VisID: 26216sl