Analiza interakcije MIF-1 s topnima oblikama CD74 z uporabo rekombinantnih proteinovDolinšek, Julija (Avtor) Turk, Boris (Mentor) CD74gelska filtracijaMIFponovno zvijanje proteinovtopni izoobliki s_p33 in s_p41CD74 je invariantna veriga molekul MHC II, ki ima pomembno vlogo pri pravilnem zvijanju, transportu in funkciji kompleksov MHC II v antigen predstavitvenih celicah. Poleg vloge pri predstavitvi antigenov deluje CD74 tudi kot membranski receptor za citokin MIF, ki sodeluje pri uravnavanju vnetnih, proliferativnih in preživetvenih signalnih poti. Strukturno je CD74 transmembranski protein z več izooblikami (p33, p35, p41 in p43), razlike med njimi pa vplivajo na njegovo znotrajcelično lokalizacijo in funkcijo. Zunajcelična domena CD74 se lahko proteolitično odcepi od membrane, pri čemer nastanejo topne oblike CD74, ki lahko vežejo MIF in s tem vplivajo na njegovo biološko aktivnost. Pri tem ostaja nejasno, ali dodatna tiroglobulinska domena, značilna za izoobliko p41, vpliva na vezavo MIF s topno obliko CD74. V okviru diplomskega dela smo zato preučevali pripravo rekombinantnega proteina MIF ter dveh topnih oblik zunajcelične domene CD74, s_p33 in s_p41, ter preverjali možnost tvorbe kompleksov med MIF in posamezno obliko CD74. Rekombinantne proteine smo izražali v bakterijskih sevih Escherichia coli BL21[DE3]pLysS in Rosetta-gami B[DE3]pLysS. Izražanje topnih oblik CD74, s_p33 in s_p41, smo potrdili s prenosom western z uporabo protiteles proti CD74. Proteini so bili izraženi kot fuzije s polihistidinsko oznako, zato smo jih lahko očistili z afinitetno Ni-NTA kromatografijo. Ker sta se s_p33 in s_p41 večinoma nahajala v netopnih frakcijah bakterijskih lizatov, smo ju solubilizirali z ureo in izvedli ponovno zvijanje. Uspešnost postopka ter oligomerizacijsko stanje in prisotnost agregiranih oblik smo analizirali z NaDS-PAGE in gelsko filtracijo. Slednja je pri proteinu MIF pokazala elucijske profile, skladne z monomerno in trimerno obliko. Z gelsko filtracijo smo preverili tudi interakciji s_p33–MIF in s_p41–MIF. Pri vzorcih s_p33 in s_p41 smo zaznali predvsem agregirane oblike, kar kaže na omejeno uspešnost ponovnega zvijanja in nizko količino pravilno zvitih topnih proteinov. Posledično so bile koncentracije biološko aktivnih oblik s_p33 in s_p41 prenizke za zanesljivo ovrednotenje vezave z MIF, zato tvorbe kompleksov ni bilo mogoče potrditi. Prav tako ni bilo mogoče zaključiti, ali tiroglobulinska domena v s_p41 vpliva na vezavo MIF. Pred nadaljnjo analizo interakcij je potrebna dodatna optimizacija izražanja, čiščenja in ponovnega zvijanja rekombinantnih oblik CD74, predvsem z namenom pridobitve večje količine pravilno zvitih in topnih proteinov.20262026-09-04 12:55:04Diplomsko delo/naloga186742VisID: 25896sl