Magnezij kot modulator alfa-aktininaMarinko, David (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) α-aktininCaMDmagnezijvezavaα-aktinin je protein, ki s svojo sposobnostjo prečnega povezovanja sodeluje pri organizaciji aktinskega citoskeleta. Nemišična α-aktinina, ACTN1 ter ACTN4, na C-končnem delu vsebujeta kalmodulinu-podobno domeno (CaMD), sestavljeno iz štirih EF-dlani. Medtem ko je vezava Ca2+-ionov na CaMD dobro opisana, je vpliv Mg2+-ionov na to domeno manj raziskan. Namen diplomskega dela je bil raziskati interakcijo med Mg2+-ioni in rekombinatnima CaMD-domenama človeških α-aktininov ACTN1 in ACTN4. Proteina smo izrazili v bakterijskem sistemu in izolirali s kombinacijo kromatografskih metod. Interakcijo med Mg2+-ioni in posamezno CaMD smo preučevali z izotermno titracijsko kalorimetrijo (ITC),vpliv Mg2+ in Ca2+-ionov na termično stabilnost proteinov pa z DLS, nanoDSF in spektroskopijo cirkularnega dikroizma (CD). Na podlagi strukturnih in koordinacijskih razlik med Ca2+ in Mg2+-ioni smo predvidevali, da bo vezava Mg2+-ionov na CaMD ACTN1 in ACTN4 šibka, oziroma nespecifična. Rezultati ITC niso pokazali jasne vezavne izoterme, ki bi lahko omogočala zanesljivo določitev termodinamskih parametrov vezave. Opaženi toplotni signali so najverjetneje posledica nespecifičnih elektrostatskih interakcij med Mg2+-ioni in negativno nabito površino proteina. Meritve pri nanoDSF so pokazale linearno naraščanje razmerja fluorescence 350 nm/330 nm. To ne kaže na denaturacijo proteina, vendar se pri meritvah velikosti delcev lahko opazi rahel prevoj, ki bi lahko pomenil denaturacijo. Ta prevoj je pri vseh vzorcih pri približno enaki temperaturi. Meritve CD so pokazale stabilizacijo strukture ob prisotnosti Ca2+-ionov. Rezultati potrjujejo hipotezo, da se Mg2+-ion na CaMD α-aktinina-1 in 4 veže nespecifično in z bistveno nižjo afiniteto kot Ca2+-ion.20262026-09-04 08:55:01Diplomsko delo/naloga186704VisID: 26224sl