De novo načrtovanje inhibitorja proteaze TEVHafner, Luka (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) Taler-Verčič, Ajda (Komentor) proteaza TEVde novo načrtovanje proteinovinhibitormodeli umetne inteligence RFdiffusionProteinMPNN in AlphaFold2Proteaza virusa jedkanja tobaka (TEVp) je pogosto uporabljeno biotehnološko orodje, za katero trenutno ne poznamo reverzibilnih proteinskih inhibitorjev. Razvoj specifičnega inhibitorja bi razširil nabor njenih aplikacij na področjih sintezne biologije in bionanotehnologije, vključno z razvojem molekularnih mehanosenzorjev. V magistrskem delu smo z uporabo orodij za napovedovanje in načrtovanje struktur, ki temeljijo na globokih nevronskih mrežah (RFdiffusion, ProteinMPNN in AlphaFold2) računalniško de novo zasnovali proteinske vezalce, ki delujejo kot inhibitorji TEVp. Pri načrtovanju smo izhajali iz strukturnih podatkov o interakciji med TEVp in njenim lastnim C-končnim delom, ki se naravno veže v aktivno mesto. Delovanje načrtovanih proteinov smo eksperimentalno ovrednotili z izražanjem v bakteriji E. coli, čiščenjem z afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti ter z merjenjem encimske kinetike. Rezultati so pokazali, da najučinkoviteje delujejo inhibitorji, ki posnemajo vezavo C-končnega dela encima. Analiza s površinsko plazmonsko resonanco (SPR) je pokazala, da imajo najboljši kandidati disociacijske konstante (KD) v nizkem nanomolarnem območju, pri čemer je bila za kandidata A8 določena vrednost KD 5,5 nM, kandidat A12 pa je izkazal najvišjo afiniteto z vrednostjo KD 1,75 nM. Z razvojem fuzijskih konstruktov, ki so namenjeni prenosu mehanske sile v bioloških mehanosenzorjih, smo dodatno ugotovili, da vnos specifičnih povezovalcev za preprečitev neželene proteolize nekoliko zmanjša afiniteto vezave v aktivno mesto, vendar proteini kljub temu ohranijo znatno inhibitorno aktivnost. Rezultati potrjujejo uspešnost računalniškega de novo načrtovanja pri razvoju funkcionalnih encimskih inhibitorjev.20262026-09-02 15:10:33Magistrsko delo/naloga186519VisID: 25480sl