Razvoj sistema za zaznavanje heterodimerizacije proteina na osnovi ločene molekule GFPMakuc, Nika (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) HeterodimerizacijaGFPločena molekula GFPp53MDM2Zeleni fluorescenčni protein (GFP) je protein, ki zaradi prisotnosti kromofora ob osvetlitvi z modro svetlobo oddaja fluorescenco zelene barve. Molekulo GFP lahko razdelimo na dva ločena fragmenta, ki ju lahko v obliki fuzije pripnemo na poljubna proteina. V primeru, da označena proteina med seboj interagirata, se fragmenta GFP spontano združita v funkcionalen protein, sposoben fluorescence. Na ta način je mogoče zaznavati in kvantificirati specifične interakcije med proteini z merjenjem intenzitete fluorescence. Cilj naloge je bil razviti sistem za zaznavanje heterodimerizacije proteinov na osnovi ločene molekule GFP v bakterijskih celicah. Sistem smo zasnovali z vnosom kasete, ki vsebuje zapis za tarčna proteina v obliki fuzije z ustreznima fragmentoma GFP, v plazmid biRNA. Za tarčna proteina smo izbrali človeška proteina p53 in MDM2, ki medsebojno interagirata in tvorita heterodimer. Na N- in C-konec zapisa za oba tarčna proteina smo vnesli kombinaciji kompatibilnih restrikcijskih mest, ki omogočajo enostavno zamenjavo tarčnih proteinov. Detekcija heterodimerizacije v razvitem sistemu omogoča hkratno merjenje intenzitete fluorescence in optične gostote bakterijskih kultur. Delovanje sistema za zaznavanje heterodimerizacije smo preverili na modelnem primeru interakcije med človeškima proteinoma p53 in MDM2 ter potrdili z uporabo pozitivne in negativne kontrole. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili C-končno domeno proteina LexA, ki tvori homodimer, kot negativno kontrolo pa protein MBP, ki je monomer. Rezultati so potrdili pravilno delovanje sistema, saj je bila pri izražanju proteinov p53 in MDM2 ter pri proteinu LexA zaznana povečana intenziteta fluorescence, kar je posledica heterodimerizacije oz. homodimerizacije in ponovne združitve fragmentov GFP. Nasprotno pa pri proteinu MBP, ki ne dimerizira, povečanja intenzitete fluorescence nismo zaznali. Vitalnost in sposobnost delitve celic smo dodatno potrdili z merjenjem optične gostote, s čimer smo izključili možnost, da bi bila povečana intenziteta fluorescence posledica povečane gostote celic.20262026-09-01 10:45:49Diplomsko delo/naloga186413VisID: 25651sl