Ovrednotenje načrtovanih signalosomov na osnovi adapterskega proteina TRIFMaučec, Ana (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) TRIFsintezni signalosomiNF-κBIRF3LCDAdapter, ki vsebuje domeno receptorjev Toll/interlevkin-1 (TIR) in sproži interferon β (TRIF), je protein prirojene imunosti, ki sodeluje pri aktivaciji transkripcijskih dejavnikov jedrnega dejavnika κB (NF-κB), interferonskega regulatornega dejavnika 3 (IRF3) in aktivacijskega proteina 1 (AP-1) navzdol od Toll-u podobnega receptorja 3 (TLR3) in TLR4 ter posreduje pri sprožitvi različnih vrst celične smrti. Sinteza provnetnih citokinov in interferonov tipa I omogoča aktivacijo obrambnih mehanizmov proti bakterijam in virusom ter spodbuja pridobljeni imunski odziv, vključno s protitumorskim. Zaradi stimulacije protitumorskega odziva je TRIF zanimiva tarča za imunoterapijo raka. Imunski odziv lahko sprožimo z uporabo agonistov TLR, vendar je njihova terapevtska uporabnost omejena. V zadnjem času se vse več pristopov osredotoča na pripravo sinteznih konstruktov, ki temeljijo na delih proteinov prirojene imunosti in lahko omogočajo tudi časovni ter prostorski nadzor nad aktivacijo imunskega odziva. Da bi posnemali delovanje naravnih signalnih kompleksov TRIF v celici, signalosomov, smo pripravili sintezne konstrukte na osnovi adapterja TRIF. Oligomerizacijo TRIF, ki je potrebna za aktivacijo IRF3 in NF-κB, smo dosegli z dodatkom domene z nizko kompleksnostjo (LCD) DNA-vezavnega proteina 43, ki se veže na transaktivacijski odzivni element (TDP43), saj le-ta omogoča spontan nastanek proteinskih kondenzatov. Da bi bil naš sistem inducibilen, smo pripravljenim sinteznih signalosomom dodali tudi dve ponovitvi homooligomerizacijske domene B (dDmrB), ki ob dodatku majhne molekule oligomerizira. V modelnem sistemu, celični liniji HEK293, smo pokazali, da sintezni signalosomi na osnovi TRIF omogočajo inducibilno tvorbo pretežno citosolnih celičnih skupkov ob dodatku dimerizatorja AP20187, neodvisno od zaporedja proteinskih domen v sinteznem signalosomu. Za njihovo tvorbo ni bila zadostna le oligomerizacija dDmrB, temveč tudi prisotnost LCD. Pokazali smo tudi, da vnos konstruktov v celice omogoča inducibilno aktivacijo transkripcijskih dejavnikov NF-κB in IRF3. Pripraviti smo tudi signalosome, ki bi pretežno aktivirali IRF3, zato smo jim odstranili motiv za homotipske interakcije proteinov, povezanih z receptorjem (RHIM). Skrajšani signalosomi so inducibilno aktivirali IRF3, vendar je bila raven aktivacije precej nižja kot pri signalosomih z RHIM, predvidoma zaradi izgube stabilnega ogrodja, ki ga tvori RHIM. Sintezne signalosome smo izrazili še v tumorski celični liniji HeLa, kjer smo zaznali aktivacijo IRF3. V okviru magistrskega dela smo uspešno pripravili funkcionalne inducibilne sintezne signalosome na osnovi TRIF s terapevtskim potencialom za imunoterapijo raka.20262026-08-27 12:40:12Magistrsko delo/naloga186149VisID: 25534COBISS_ID: 290825475sl