Zaviranje poškodbe celične membrane z delovanjem na C-konec ninjurina 1Jakop, Nina (Avtor) Pišlar, Anja (Mentor) Hafner Bratkovič, Iva (Komentor) Ninjurin 1poškodba celične membranevnetjeprotitumorska terapijaNinjurin 1 je transmembranski protein, ki po nastopu litične celične smrti polimerizira in povzroči poškodbo celične membrane, sprostitev znotrajceličnih molekul in s tem aktivacijo vnetja, ki pomembno vpliva na potek kroničnih vnetnih bolezni. Namen magistrskega dela je bil razviti dva pristopa k uravnavanju ninjurina 1 z delovanjem na C-konec. V prvem delu smo izvedli predstavitev na bakteriofagu z uporabo knjižnic Tomlinson I in J z namenom izolacije enoverižnih fragmentov variabilne regije protiteles, ki vežejo C-konec ninjurina 1. Z zaviranjem delovanja ninjurina 1 zaradi vezave protiteles bi namreč lahko dosegli omiljen potek kroničnega vnetja. Izvedli smo tri zaporedne stopnje elucije z zaostrujočimi pogoji spiranja, nato pa še encimsko-imunski test, s katerim smo preverili uspešnost selekcije. Rezultati so pokazali, da nam z metodo predstavitve na bakteriofagu ni uspelo pridobiti klona, ki bi izkazoval močno afiniteto do ninjurina 1. Nato smo se osredotočili na raziskovanje ali lahko poškodbo celične membrane uravnavamo tako, da na C-konec ninjurina 1 pripojimo globularno proteinsko domeno preko distančnika. V ta namen smo z metodami molekulskega kloniranja pripravili več konstruktov ninjurin 1-distančnik-globularna domena in z vnosom konstruktov v človeško celično linijo spremljali vpliv različnih komponent konstrukta na litično delovanje ninjurina 1. Delež celične smrti smo spremljali z merjenjem stopnje prevzema propidijevega jodida v celice in sproščanja laktat dehidrogenaze iz celic. Ugotovili smo, da večje globularne domene in krajši distančniki bolje zavirajo ninjurin 1. Ustvarjene konstrukte smo nato poskušali razcepiti na cepitvenem mestu, ki smo ga vnesli v distančnik in s tem reaktivirati ninjurin 1. To nam je uspelo v omejenem obsegu. Z načrtovano sprožitvijo imunogene celične smrti v tumorskem mikrookolju zaradi opisanega zaviranja in aktiviranja delovanja ninjurina 1 bi v tumorskem mikrookolju izzvali lokalno vnetje, kar bi predstavljalo inovativen pristop v protitumorski terapiji. V magistrskem delu smo poizkušali razviti dva načina uravnavanja poškodbe celične membrane, ki jo posreduje ninjurin 1. Čeprav nam z metodo predstavitve na bakteriofagu ni uspelo razviti fragmentov protiteles z močno afiniteto, smo v drugem delu raziskali inovativen način uravnavanja litične aktivnosti ninjurina 1. Pokazali smo, da lahko z delovanjem na C-konec ninjurina 1 učinkovito zavremo poškodbe celične membrane, kar bo vodilo v razvoj novih pristopov za nadzorovano sprožitev celične lize, predvsem pri imunoterapiji raka.[N. Jakop]20262026-08-25 08:45:34Magistrsko delo/naloga185975UDK: 577.2:576.3(043.2)VisID: 127186COBISS_ID: 288938755sl