Analiza izražanja in fosforilacije mutant RNA-vezavnega proteina FUSProdan, Neja (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) FUSfosforilacijakinazeagregatiALSAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta nevrodegenerativni bolezni z značilnim kopičenjem citoplazemskih agregatov RNA vezavnih proteinov, med katerimi je protein FUS. Ta v normalnih pogojih deluje pretežno v jedru, sodeluje pa pri uravnavanju transkripcije, procesiranju RNA in popravljanju poškodb DNA. Mutacije v genu FUS, zlasti v C-končnem jedrnem lokalizacijskem signalu (PY-NLS), so povezane z družinskimi oblikami ALS, medtem ko se citoplazemski agregati divjega tipa FUS (FUSwt) pojavljajo tudi pri FTD. Pri tem ima pomembno vlogo fosforilacija tirozina 526 (Y526) v PY-NLS, ki onemogoči vezavo na protein transportin-1, s čimer prepreči uvoz proteina FUS v jedro, kar vodi v njegovo citoplazemsko kopičenje in agregacijo. Fosforilacijo Y526 proteina FUS katalizirajo kinaze družine Src (cAbl, cSrc in cFyn), ki so aktivne v različnih znotrajceličnih kompartmentih. Preučevali smo vpliv C-končnih mutacij proteina FUS, FUSR521C in FUSP525L, na jedrno-citoplazemsko razporejanje in agregacijo proteina FUS v celicah HEK293T ter kako soizražanje različic proteina FUS (FUSwt, FUSR521C in FUSP525L) s konstitutivno aktivnimi kinazami (cAbl, cSrc in cFyn) vpliva na fosforilacijo Y526 in na število ter morfologijo citoplazemskih agregatov. Fosforilacijo na Y526 (FUSp-Y526) smo zaznali s specifičnim protitelesom. Uporabili smo metode imunocitokemijskega označevanja, konfokalne mikroskopije in kvantitativne analize slik, s čimer smo ovrednotili nukleocitoplazemsko razmerje fosforiliranega FUSp-Y526 in FUS. Rezultati kažejo, da obe mutirani obliki povzročita povečano citoplazemsko kopičenje mutirane oblike FUS, kar kaže na močno okrnjen jedrni uvoz. Soizražanje različic proteina FUS s kinazo cAbl poveča citoplazemsko kopičenje fosforiliranega proteina FUSp-Y526, medtem ko soizražanje s cSrc in cFyn potrdi močno jedrno lokalizacijo fosforiliranega proteina FUSp-Y526. Kinaze tudi različno vplivajo na pojav ali izginotje agregatov mutiranih različic proteina FUS. Povzamemo lahko, da tako mutaciji na C-koncu in v PY NLS kot fosforilacija Y526 proteina FUS vplivajo na razporeditev proteina FUS v celici. Učinek na znotrajcelično razporejanje in tvorbo agregatov različic proteina FUS je odvisen od vrste kinaze in mutacije. Naše ugotovitve prispevajo k razumevanju molekularnih mehanizmov agregacije FUS pri ALS ter odpirajo možnosti za nadaljnje raziskave vloge tirozin kinaz pri nevrodegenerativnih boleznih.20262026-08-20 13:45:04Diplomsko delo/naloga185800VisID: 25926sl