Detekcija dimerizacije proteina TDP-43 s presejalnima sistemoma Tox in LexTepuš, Taja (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) TDP-43presejalni sistemToxLexamiotrofična lateralna sklerozadimerizacijaProtein z molekulsko maso 43 kDa, ki veže transaktivacijski odzivni element molekule DNA, znan tudi kot TDP-43, je visoko ohranjen RNA- in DNA-vezavni protein, vključen v uravnavanje procesiranja RNA. Pretežno se nahaja v jedru, kopičenje agregatov v citoplazmi pa je značilno za bolnike z amiotrofično lateralno sklerozo (ALS) in frontotemporalno demenco (FTD). TDP-43 je sestavljen iz N-končne domene, dveh RNA-prepoznavnih domen, C-končne domene, jedrnega lokalizacijskega signala in signala za transport iz jedra. V tem diplomskem delu smo detektirali dimerizacijo TDP-43 s presejalnima sistemoma Tox in Lex z uporabo celotnega proteina TDP-43 in njegovih dveh delecijskih mutantov. Zapise za TDP-43 in dva delecijska mutanta, TDP-43ΔNTD in TDP-43ΔNTDΔRRM1, smo pomnožili s PCR iz obstoječih plazmidov, pri čemer smo pripravili tudi različice z dodanim fuzijskim partnerjem vezavni protein za maltozo (MBP) na C-koncu. Pripravljene konstrukte smo vstavili v sistema Tox in Lex ter spremljali fluorescenco kot posledico dimerizacije testnega proteina. Sistem Tox je aktivatorski, kar pomeni, da se v primeru homodimerizacije testnega proteina fluorescenca poviša. Nasprotno se zgodi pri sistemu Lex, ki je represorski, saj se ob homodimerizaciji testnega proteina fluorescenca zniža. TDP-43 je v obeh sistemih pokazal statistično značilen signal dimerizacije. Pri delecijskih mutantah TDP-43ΔNTD in TDP-43ΔNTDΔRRM1 rezultata med sistemoma nista bila skladna, saj smo v sistemu Tox pri obeh mutantah zaznali šibko dimerizacijo, medtem ko v sistemu Lex dimerizacije nismo zaznali. Dodatek fuzijskega partnerja MBP na C-konec delecijskih mutantov je v obeh sistemih zmanjšal signal dimerizacije pri mutantih, medtem ko je pri TDP-43 dimerizacijski signal ostal enak, oziroma višji. Rezultati kažejo, da je za dimerizacijo proteina TDP-43 pomembna N-končna domena.20262026-08-19 08:45:04Diplomsko delo/naloga185723VisID: 25952COBISS_ID: 289277699sl