Vrednotenje korelativne mikroskopije za identifikacijo avtofagosomskih predelkov v rakavih urotelijskih celicah po tretiranju z izvlečkom človeške amnijske membraneRobek, Tinkara (Avtor) Erdani Kreft, Mateja (Mentor) avtofagijarakave urotelijske celice (T24)človeška amnijska membrana (hAM)LC3B-IIkorelativna mikroskopija (CLEM)Avtofagija ima ključno vlogo pri ohranjanju celične homeostaze in je v rakavih celicah pogosto spremenjena. Izvlečki človeške amnijske membrane (hAM) izkazujejo protivnetne in protitumorske učinke, njihov vpliv na avtofagijo urotelijskih celic pa še ni pojasnjen. Namen diplomskega dela je bil ovrednotiti uporabnost korelativne mikroskopije (CLEM), ki združuje slikanje istega celičnega področja najprej s svetlobno in nato še z elektronsko mikroskopijo, za identifikacijo avtofagosomskih predelkov v rakavih urotelijskih celicah T24 po 24-urnem tretiranju z izvlečkom hAM. Celice smo kemijsko fiksirali, vklopili v želatino in po metodi Tokuyasu pripravili krioultratanke rezine, na katerih smo imunooznačili označevalec avtofagije LC3B (Alexa Fluor 555) in označili jedra (Hoechst). Iste regije smo zaporedoma posneli s konfokalnim in presevnim elektronskim mikroskopom ter mikrografije korelirali s programsko opremo ImageJ/Fiji in vtičnikom BigWarp. V sedmih sklopih imunooznačevanja (skupno 18 mrežic in 7 koreliranih vzorcev) je barvilo Hoechst zanesljivo označilo jedra in omogočilo korelacijo med svetlobno in elektronsko ravnino, medtem ko je bil signal LC3B šibek in pretežno nespecifičen. Elektronska mikroskopija v naših vzorcih večinoma ni omogočila nedvoumne prepoznave dvomembranskih veziklov. Zaradi teh omejitev in artefaktov pri pripravi vzorcev po metodi Tokuyasu (nespecifična vezava protiteles, gubanje in trganje rezin ter sploščena morfologija celic) formalne kvantifikacije avtofagosomov nismo izvedli. Rezultati kažejo, da metoda v trenutni obliki še ni optimizirana za kvantitativno analizo avtofagosomskih predelkov v celicah T24, hkrati pa predstavljajo pomembno metodološko izhodišče in smernice za nadaljnjo optimizacijo protokola ter njegovo kombinacijo z molekularnimi metodami (prenos western, qPCR).20262026-08-17 10:55:19Diplomsko delo/naloga185665VisID: 26095COBISS_ID: 289200387sl