Homodimerizacija proteina ORF1p iz LINE-1 v presejalnih sistemih s ToxR in LexA v E. coliOsterc, Igor (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) ORF1pLINE1homodimerizacijaLexAToxRRetrotranspozon LINE1 je edini samostojno aktiven mobilni genetski element v človeškem genomu. Zaporedje LINE1 zapisuje za proteine ORF0p, ORF1p in ORF2p. Protein ORF1p v aktivni obliki tvori homotrimere, ki v sodelovanju z ORF2p izvedejo celoten proces retrotranspozicije. ORF1p veže lastno kodirajočo mRNA in deluje kot šaperon nukleinskih kislin. Odgovoren je za tvorbo ribonukleoproteinskega (RNP) kompleksa. Sistema LexA in ToxR sta bila ustvarjena z namenom zaznavanja homodimerizacije proteinov. Temeljita na bakterijskih transkripcijskih faktorjih LexA in ToxR. Ta sta aktivna v homodimerni obliki in sta sestavljena iz DNA vezavne ter dimerizacijske domene. Če namesto dimerizacijske domene LexA oz. ToxR vstavimo zapis za izbrani protein, lahko na podlagi signala, ki nam ga da reporterski protein, določimo, ali vstavljen protein homodimerizira ali ne. Z namenom določitve homodimerizacije proteina ORF1p smo zapis za protein klonirali v sistema LexA in ToxR. Prav tako smo za primerjavo v oba sistema klonirali zapis za mutirano obliko proteina z imenom JMIII. Poleg tega smo določali dimerizacijo tudi skrajšanima zapisoma za ORF1p in JMIII, katerima smo iz izhodnih zapisov odstranili zapis za neurejene dele na N-koncu. Rezultati so pokazali razliko med sistemoma LexA in ToxR. ORF1p je v sistemu LexA pokazal določeno stopnjo homodimerizacije, medtem ko je mutirana oblika JMIII ni. V sistemu ToxR tako ORF1p kot tudi JMIII nista homodimerizirala. V nadaljnjih poskusih smo z odstranitvijo neurejenih delov proteinov ORF1p in JMIII zagotovili večjo uspešnost uporabljenih sistemov. Rezultati skrajšanih oblik so namreč pokazali višjo stopnjo homodimerizacije ORF1p v sistemu LexA, JMIII pa enako kot prej ni tvoril homodimerov. Razlike med ORF1p in JMIII v sistemu LexA nakazujejo, da se mutacije nahajajo na strukturno pomembnih delih proteina, ki so ključni za povezovanje v višje strukture. V sistemu ToxR smo s skrajšanjem zaporedij proteinov zagotovili homodimerizacjo tako ORF1p kot tudi JMIII. Predpostavili smo, da je do razlik med rezultati sistemov LexA in ToxR verjetno prišlo zaradi mutacije v promotorju ToxR sistema ToxR, ki smo jo kasneje dokazali s poravnavo zaporedij. Postopke bi morali dodatno optimizirati, da bi dobili bolj jasne rezultate homodimerizacije naših dveh proteinov. Prav tako bi bilo potrebno uporabljeno metodo za ugotavljanje homodimerizacije preveriti še na kakšnem homotrimeru.20262026-07-10 07:45:01Diplomsko delo/naloga184562VisID: 25641COBISS_ID: 288473347sl