Proteinski inženiring oligomerne različice celulaze bglC z uporabo termostabilne tetramerizacijske domene p53Starc, Gaja (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) celulaza bglCendoglukanazacelulozaoligomerizacijatetramerizacijska domena p53Celulaze klasično delimo v tri skupine encimov, ki sinergistično sodelujejo pri hidrolizi celuloze: endoglukanaze (EC 3.2.1.4), eksoglukanaze (EC 3.2.1.91) in β-glukozidaze (EC 3.2.1.21). Celulaze vseh skupin so ključne za pretvorbe lignoceluloznih materialov in so vsestransko uporabne v industriji. Kompleksna sestava celuloze in omejitve obstoječih encimov pri razgradnji celuloze vseeno predstavljajo izzive pri širši praktični uporabi. Učinkovitejšo uporabo celulaz v industrijskih procesih je mogoče doseči z izboljšanjem katalitične aktivnosti encimov, povečanjem njihove stabilnosti in razumevanjem zahtev za uporabo v specifičnih procesih ter inženirstvom encimov, prilagojenih zanje. Eno izmed področij izboljšav je oligomerizacija. Oligomerni encimi so pogosto odpornejši na ekstremne pogoje, hkrati pa lahko oligomerizacija izboljša adsorpcijo encimov na netopne substrate. V sklopu magistrskega dela smo skušali z uporabo termostabilne tetramerizacijske domene p53 (p53TD_Q331R) kot C-končne fuzije pripraviti tetramerno različico celulaze bglC, endoglukanaze iz bakterije Bacillus subtilis. Zanimalo nas je ali fuzijski protein oligomerizira in ali spremenjeno oligomerno stanje vpliva na aktivnost razgradnje polimernega substrata karboksimetilceluloze. Zapis za fuzijski protein smo pripravili s sestavljanjem po Gibsonu, nato pa izrazili in izolirali obe različici endoglukanaze ter določili njuno oligomerno stanje z uporabo velikostne izključitvene kromatografije in masne fotometrije. Aktivnost obeh različic smo preučevali z uporabo testa DNS ter tako določili pripadajoče kinetične parametre. Tetramerne različice celotnega fuzijskega proteina nam ni uspelo pripraviti, najverjetneje zaradi proteolitičnih cepitev fuzijskega proteina na področju povezovalne regije med domenama celulaze bglC. Proteolitične cepitve in odsotnost tetramerizacije bi lahko vplivale tudi na nižjo navidezno aktivnost fuzijskega proteina v primerjavi z rekombinantno celulazo bglC divjega tipa.20262026-07-08 14:10:32Magistrsko delo/naloga184496VisID: 25929sl