Določanje vpliva plektina na razporeditev proteina tau in dinamiko mikrotubulov v mišjih astrocitih s superločljivostno mikroskopijo STED in konfokalno mikroskopijoKovačić, Marko (Avtor) Jorgačevski, Jernej (Mentor) imortalizirani mišji astrocitiplektinmikrotubuliprotein tauSTEDkonfokalna mikroskopijaAstrociti imajo številne funkcije, s katerimi vzdržujejo homeostazo v centralnem živčnem sistemu. Pomemben povezovalni protein elementov citoskeleta v astrocitih je plektin, večfunkcionalni citolinkerski protein iz družine plakinov. Ker je malo znanega o vplivu plektina na dinamične lastnosti mikrotubulov in lokalizacijo proteina tau v astrocitih, smo to želeli preveriti v imortaliziranih mišjih astrocitih, ki izražajo plektin (Plec+/+p53-/-) in ki ne izražajo plektina (Plec-/-p53-/-). Dinamiko mikrotubulov smo spremljali s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo živih celic, pri čemer smo rastoče konce mikrotubulov označili s proteinom Eb3, sklopljenim z zelenim fluorescenčnim proteinom. Ugotovili smo, da mikrotubuli v odsotnosti plektina polimerizirajo hitreje. Ugotovili smo, da imajo mikrotubuli v odsotnosti plektina večji koeficient usmerjenosti polimerizacije, bolj radialno usmerjeno rast in manjšo kotno disperzijo rasti glede na centroid celice. Plektin ni imel vpliva na število iniciacij rasti novih mikrotubulov in na gostoto rastočih mikrotubulov v celicah. Ugotovili smo, da so mikrotubuli v odsotnosti plektina manj fragmentirani, bolj prepleteni in imajo večjo celokupno dolžino, normirano na ploščino celice. Tako v mišjih astrocitih Plec+/+p53-/- kot tudi v mišjih astrocitih Plec-/-p53-/- smo ugotovili relativno visoko stopnjo izražanja proteina tau, ki se je pojavljal v skupkih. Kvalitativno nismo zaznali, da bi skupki proteina tau kolokalizirali z mikrotubuli. Ugotovili smo, da protein tau v odsotnosti plektina zaseda večji delež imortaliziranih mišjih astrocitov in da se večji delež proteina tau nahaja v perifernem delu celic v primerjavi z astrociti, ki izražajo plektin. S superločljivostno mikroskopijo z vzbujenim praznjenjem emisije (STED) smo ugotovili, da so skupki proteina tau gostejši v odsotnosti plektina. Omenjeni fenotip smo poskusili rešiti z lipofekcijo astrocitov Plec-/-p53-/-, in sicer z vnosom zapisa za izoobliko plektina P1c. Transfekcija je bila uspešna, vendar med transficiranimi in netransficiranimi celicami ni bilo razlike v gostoti in lokalizaciji skupkov proteina tau. Ugotovili smo, da je postopek lipofekcije bistveno znižal delež in gostoto skupkov proteina tau ter spremenil njihovo lokalizacijo tako v transficiranih kot v netransficiranih celicah v primerjavi z mišjimi astrociti v eksperimentu brez lipofekcije. Naši rezultati nakazujejo, da plektin vpliva na lastnosti mikrotubulov in razporeditev proteina tau v imortaliziranih mišjih astrocitih. V nadaljevanju bi bilo treba preveriti, kakšen je mehanizem vpliva plektina na omenjene lastnosti in kaj so razlogi, da se protein tau nahaja v obliki skupkov v imortaliziranih mišjih astrocitih. Potrebno bi bilo preučiti vpliv plektina na dinamiko mikrotubulov in razporeditev proteina tau tudi v primarnih astrocitih.20262026-07-07 12:35:02Magistrsko delo/naloga184437VisID: 25479sl