Uporaba toksičnega proteina kot senzorja uspešnosti izločanja proteinov v kvasovki Saccharomyces cerevisiaeGabrič, Maša (Avtor) Petrovič, Uroš (Mentor) Saccharomyces cerevisiaetoksični proteinisekrecijasignalni peptid α-faktorjapromotor GAL1CRISPR-Cas9V industrijski biotehnologiji je pomemben izziv razvoj sevov mikroorganizmov z izboljšano sposobnostjo izločanja rekombinantnih proteinov. Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je pogosto uporabljen organizem v biotehnologiji zaradi svoje genetske organiziranosti in enostavnega gojenja, vendar je njena učinkovitost izločanja proteinov v primerjavi z drugimi sistemi omejena. V sklopu magistrske naloge smo želeli razviti metodo, ki bi omogočila razvoj seva S. cerevisiae z izboljšanim izločanjem proteinov. Za razvoj takšne metode smo uporabili endogene toksične proteine in signalni peptid feromona α-faktorja. Najprej smo izbrali toksične proteine, katerih prekomerno izražanje vodi v zmanjšano viabilnost celic. Osredotočili smo se na protein Arf1, ki sodeluje pri vezikularnem transportu, in Kar2, ki je pomemben šaperon v endoplazemskem retikulumu. Z uporabo različic promotorja GAL1 smo uravnavali njuno izražanje ter preučili vpliv signalnega peptida α-faktorja na njuno sekrecijo. Pričakovali smo, da bo usmeritev proteina v sekretorno pot zmanjšala njegovo toksičnost in omogočila selekcijo tistih sevov, ki protein najbolj učinkovito izločajo. V eksperimentalnem delu smo uporabili tehniko CRISPR-Cas9 za vstavitev skrajšanih različic promotorja GAL1 in zapisa za signalni peptid α-faktorja v genom sevov S. cerevisiae. Nastale mutante smo analizirali s fenotipskimi testi, določanjem hitrosti rasti ter analizo proteinov z SDS-PAGE in prenosom western. Ugotovili smo, da protein Kar2 v uporabljenem sistemu ne deluje toksično. Nasprotno pa protein Arf1 kaže toksičen učinek, če je prekomerno izražen. Fuzija Arf s signalnim zaporedjem α-faktorja, na celico ni imela toksičnega učinka, vendar pa smo pokazali tudi, da sekrecija proteina ni bila uspešna. Rezultati kažejo, da je izbira toksičnega proteina ključna za delovanje sekrecijskega sistema. Čeprav je Arf1 sprva deloval kot potencialen kandidat, se je izkazalo, da dodatek signalnega zaporedja ne zadostuje za njegovo učinkovito izločanje. Nadaljnje raziskave bi lahko vključevale prilagajanje signalnih zaporedij in optimizacijo sekrecijske poti za specifične proteine, kar bi še dodatno izboljšalo učinkovitost biotehnoloških procesov.20262026-07-06 09:36:49Magistrsko delo/naloga184369VisID: 23091COBISS_ID: 286586371sl