Vrednotenje krioprezervacije celic pri visoki gostoti v kriovrečkah kot vmesnega koraka v dohranjevalnih in intenziviranih dohranjevalnih pripravljalnih procesihRojc, Eva (Avtor) Mravljak, Janez (Mentor) Bizjak, Maruša (Komentor) Kriovrečke s celicami zamrznjenimi pri visokih celičnih gostotahintermediat v začetnem pripravljalnem biotehnološkem procesušaržni proces z dohranjevanjemintenzificirani šaržni proces z dohranjevanjempripravljalni biotehnološki procesi.Biološka zdravila se pridobivajo v živih sistemih, pri čemer monoklonska protitelesa razreda G predstavljajo najpogostejšo in najbolj razširjeno skupino odobrenih bioloških zdravil. Njihova glavna prednost je visoka specifičnost, ki omogoča selektivno tarčno usmerjeno delovanje, kar lahko prispeva k večji učinkovitosti zdravljenja ter manjšemu pojavu neželenih učinkov. Da bi bili terapevtski proteini po sintezi funkcionalni in biološko aktivni, morajo biti pravilno zviti ter ustrezno posttranslacijsko modificirani, zlasti glikozilirani. Za njihovo proizvodnjo so bili razviti različni ekspresijski sistemi, vendar ovarijske celice kitajskega hrčka najbolje izpolnjujejo zahteve za tvorbo kompleksnih terapevtskih proteinov, zato predstavljajo najpogosteje uporabljen gostiteljski sistem za proizvodnjo rekombinantnih monoklonskih protiteles in fuzijskih proteinov. Optimizirane proizvodne celične linije shranjujemo v celičnih bankah. Pri tem je dimetilsulfoksid najpogosteje uporabljen krioprotektant, čeprav je njegova uporaba povezana z možnostjo citotoksičnih učinkov. Pri krioprezervaciji je pomembno dodati optimalno koncentracijo dimetilsulfoksida kot krioprotektanta, saj prenizka koncentracija celicam ne zagotavlja zadostne zaščite pred poškodbami, povezanimi z zamrzovanjem, medtem ko je previsoka koncentracija lahko toksična zaradi interakcij z različnimi proteini in strukturami znotraj celice. Proizvodni del procesa se začne z odmrzovanjem zamrznjene celične suspenzije, čemur sledi namnoževanje celic in nato inokulacija šaržnega bioprocesa z dohranjevanjem, v katerem celice začnejo proizvajati želeni produkt. V zadnjem času je veliko pozornosti namenjene intenzifikaciji procesov, ki jo je mogoče uvesti na ravni celičnih bank in krioprezervacije, priprave inokuluma ter procesa proizvodnje protiteles. V literaturi se med najpogosteje opisanimi pristopi intenzifikacije navajajo: • krioprezervacija pri visoki celični gostoti, ki lahko skrajša pripravo inokuluma in omogoči neposredno nacepitev večjih bioreaktorjev, • perfuzijsko vodeni procesi v pripravi inokuluma, ki omogočajo namnoževanje do zelo visokih koncentracij celic, • šaržni bioprocesi z dohranjevanjem z visoko začetno celično koncentracijo (začetna inokulacija 4–10 × 10^6 celic/mL namesto običajnih 0,2–1 × 10^6 celic/mL), s čimer se skrajša neproduktivna faza rasti in izboljša celotna učinkovitost procesa. Glavni cilj magistrske naloge je bil oceniti možnost uporabe celic ovarija kitajskega hrčka, krioprezerviranih v kriovrečkah pri visoki celični gostoti, kot intermediata za inokulacijo vi bioreaktorja znotraj proizvodnje, namenjenega namnoževanju celic v zaprtem sistemu. V proizvodnji je v prvih 9 do 16 dneh procesa namnoževanja celic običajno potrebnih več kritičnih aseptičnih odprtih operacij, kar v proizvodnih obratih zahteva čistost delovnega okolja razreda A. Po zaključku teh korakov se vse nadaljnje stopnje namnoževanja celic izvajajo v bioreaktorjih znotraj popolnoma zaprtih sistemov v okolju razreda D. Uporaba kriovrečk z visoko gostoto celic bi v proizvodnji povečal operativno prilagodljivost ter hkrati odpravila potrebo po odprtih aseptičnih postopkih v laminarnih komorah. V prvem delu magistrske naloge smo ovrednotili najvišjo celično gostoto, ki jo je bilo še mogoče uspešno krioprezervirati v kriovrečkah. Priprava kriovrečk z visoko celično gostoto je bila omejena z lastnostmi uporabljenega sistema za koncentriranje celic, in sicer 20-litrske bioreaktorske vreče zibajočega se bioreaktorskega sistema z integrirano perfuzijsko membrano. Z uporabo pristopa načrtovanja eksperimentov smo preučevali vpliv dodane količine dimetilsulfoksida v zamrzovalni suspenziji in celične gostote v času krioprezervacije pri konstantnem volumnu in konstantnem času izpostavljenosti dimetilsulfoksidu na učinkovitost krioprezervacije celic v kriovrečkah. Vključena je bila tudi negativna kontrola brez dimetilsulfoksida. Rezultati so pokazali, da pri celicah, krioprezerviranih pri gostoti 100 × 10^6 celic/mL, med preizkušenimi odstotki dodanega dimetilsulfoksida (3 %, 5 % in 7 %) v krioprezervacijskem mediju ni bilo opaziti statistično pomembnih razlik v živosti, podvojevalnem času populacije in rasti. Nasprotno pa so bile pri višjih celičnih gostotah v času krioprezervacije, 300 in 500 × 10^6 celic/mL, v prvi pasaži opažene statistično značilne razlike v živosti, podvojevalnem času populacije in rasti med skupinami z različnim odstotki dodanega dimetilsulfoksida v zmrzovalnem mediju. Pri celicah, krioprezerviranih pri gostotah 300 in 500 × 10^6 celic/mL, je uporaba 5 % dimetilsulfoksida omogočila najvišjo živost po odmrzovanju, najhitrejšo rast in najkrajši podvojevalni čas populacije v prvi pasaži. V drugi pasaži so razlike med posameznimi pogoji izginile, kar kaže, da je bil vpliv pogojev krioprezervacije omejen predvsem na neposredno obdobje takoj po odmrzovanju. Model, izdelan na podlagi pristopa načrtovanja eksperimentov, je napovedal, da je med preizkušenimi pogoji najugodnejša krioprezervacija pri celični gostoti 100 × 10^6 celic/mL in uporabi 5 % dimetilsulfoksida v zamrzovalni suspenziji. V drugem delu smo celice, krioprezervirane v kriovrečkah pri visoki celični gostoti, odmrznili in gojili v stresalnih erlenmajericah, ki so služile kot simulacija procesnih korakov namnoževanja celične kulture N-3, N-2 in N-1. V večini proizvodnih obratov se ti koraki namnoževanja celične kulture izvajajo v zaprtih bioreaktorskih sistemih, ki obratujejo v okolju razreda D. Kulture iz stresalnih erlenmajeric smo nato uporabili za nacepitev bioreaktorjev v dohranjevalnih šaržnih bioprocesih. Vzporedno smo celice, krioprezervirane v kriovrečkah, odmrznili v stresalne erlenmajerice in jih v najkrajšem možnem času prenesli v perfuzijski zibajoči se bioreaktor stopnje N-1, ki smo ga nato uporabili za nacepitev intenzificiranega dohranjevalnega šaržnega bioprocesa. Med procesom produkcije želenega proteina smo spremljali gostoto živih celic, živost, koncentracijo protiteles in ravni metabolitov. Na koncu smo koncentracijo protiteles, doseženo na zadnji dan procesov, začetih iz kriovrečk z visoko celično gostoto, primerjali s koncentracijo, doseženo v procesu, začetem s celično kulturo iz kriovial in vodenim pod standardnimi operativnimi postopki, ki so v intelektualni lasti podjetja Novartis d.o.o. Rezultati drugega dela raziskave so pokazali, da so bile največje razlike opažene v presnovnih profilih pri dohranjevalnih šaržnih procesih, ki so bili inokulirani s kulturo, odtaljeno direktno v N-1 procesnem koraku namnoževanja celične kulture. Višje rezidualne koncentracije glukoze in glutamina kažejo na manjšo porabo glukoze in glutamina v procesih, začetih iz kriovrečk s skrajšano stopnjo namnoževanja celične kulture. Kljub tem presnovnim razlikam med primerjanimi procesi nismo opazili večjih razlik v končni koncentraciji protiteles. Pri intenzificiranem dohranjevalnem šaržnem procesu nismo opazili večjih razlik v končni koncentraciji protiteles, prav tako pa ni bilo večjih razlik v porabi hranil. Vzporedno pa so procesi s prekomernim dodajanjem hranil dosegli opazno nižje koncentracije protiteles v primerjavi z procesi brez prekomernega dohranjevanja, kar kaže, da povečana oskrba s hranili ni bila učinkovito izkoriščena za produktivnost, temveč so se hranila kopičila v mediju. Rezultati nakazujejo, da bi se kriovrečke s celicami, zamrznjenimi pri visokih celičnih gostotah, lahko uporabljale kot intermediat v začetnem pripravljalnem biotehnološkem procesu za nacepitev bioreaktorja v popolnoma zaprtem sistemu, ne da bi bil pri tem ogrožen končni titer produkta. Opažene razlike v porabi glukoze in glutamina pri dohranjevalnih šaržnih procesih z le eno predhodno pasažo pa bi lahko vplivale na kakovost produkta.[E. Rojc]20262026-06-16 08:46:19Magistrsko delo/naloga183596UDK: 615.32+615.2-021.321(043.3)VisID: 125489COBISS_ID: 281759235sl