Optimizacija večbarvne pretočne citometrije za imunofenotipizacijo človeških primarnih mezenhimskih matičnih/stromalnih celicSelan Podpečan, Nina (Avtor) Zupan, Janja (Mentor) Ključne besede: mezenhimske matične/stromalne celice (MSC)večbarvna pretočna citometrijaimunofenotipizacijaoptimizacijaperinatalne MSCMezenhimske matične/stromalne celice (MSC) predstavljajo heterogeno populacijo celic, ki se v mirujočem, nediferenciranem stanju nahaja v številnih vezivnih tkivih. Njihova zanesljiva identifikacija je ključna za raziskave in uporabo v regenerativni medicini. Ker specifičen označevalec ne obstaja, je za njihovo identifikacijo potrebno analizirati nabor pozitivnih in negativnih celičnih označevalcev. Večbarvna pretočna citometrija omogoča takšno natančno imunofenotipizacijo MSC, vendar zahteva skrbno načrtovanje in optimizacijo panela. Namen magistrskega dela je bila optimizacija panela za večbarvno pretočno citometrijo za imunofenotipizacijo primarnih humanih MSC, s poudarkom na celicah iz perinatalnih tkiv. Na podlagi smernic Mednarodnega združenja za celično in gensko terapijo (angl. International Society for Cell and Gene Therapy; ISCT) in pregleda literature smo izbrali ustrezne negativne (CD45, CD235a, CD146) in pozitivne označevalce (CD73, CD105, CD90) ter dodatna označevalca PDPN in CD164 za opredelitev nove populacije humanih skeletnih matičnih celic (angl. human skeletal stem cells, hSSC). Panel smo optimizirali s postopnim vključevanjem protiteles, določitvijo optimalnih volumnov ter prilagoditvijo nastavitev pretočnega citometra. Uspešnost optimizacije panela smo preverili s kontrolami s selektivno izločenim posameznim fluorokromom (angl. fluorescence minus one, FMO), ki so nam bile v pomoč tudi pri določitvi ustreznih mej med pozitivnimi in negativnimi populacijami. Rezultate optimizacije smo sproti analizirali in iskali možnosti za izboljšave v panelu. Analiza kontrol FMO nam je dala boljši vpogled v oceno ozadja fluorescence in potencialnega spektralnega prekrivanja ter širjenja signala. Uporabnost optimiziranega panela smo preverili na vzorcih primarnih celic pridobljenih iz placente, kjer smo z imunofenotipizacijo določili deleže preiskovanih celičnih populacij. Rezultati so pokazali visoko izražanje CD73 ter variabilno izražanje CD105 in CD90, kar odraža heterogenost MSC populacij, medtem ko je izražanje PDPN nakazovalo na prisotnost subpopulacij MSC. Optimiziran panel predstavlja uporabno metodo za imunofenotipizacijo MSC s standardnimi in novejšimi označevalci ter pomembno osnovo za nadaljnje raziskave na področju matičnih celic. Hkrati je panel pomembna osnova, ki dopušča nadaljnje izboljšave in nadgradnjo potencialnih novih označevalcev.[N. Selan Podpečan]20262026-06-12 08:45:18Magistrsko delo/naloga183396UDK: 602.9(043.2)VisID: 125454COBISS_ID: 281587203sl