Priprava in karakterizacija proteina TEX264Kovač, Ela (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) DPCTEX264$^{∆30}$TEX264priprava rekombinantnih proteinovDNA je močno dovzetna za poškodbe, ki nastanejo zaradi delovanja endogenih in eksogenih dejavnikov. Med poškodbe DNA uvrščamo tudi nekatere kovalentne povezave med DNA in proteini (ang. DNA-protein crosslink ali DPC), ki nastanejo, ko se proteini ireverzibilno kovalentno vežejo na kromosomsko DNA. Pogosta oblika teh povezav so kompleksi TOP1−DPC, ki nastanejo ob kovalentni vezavi topoizomeraze I (TOP1) na DNA v obliki encima−DNA intermediata. Pri sesalcih odstranjevanje DPC-jev vključuje proteazo SPRTN in homoheksamerno AAA+ ATPazo p97 (znano tudi kot VCP ali Cdc48 pri kvasovkah). Nedavno je bil identificiran njen adapterski protein TEX264, ki prepozna poškodbe tipa TOP1−DPC in usmerja p97 na mesto poškodbe, kjer p97 razvije kovalentno vezan protein TOP1. Mehanizem delovanja proteina TEX264 je zaenkrat še slabo raziskan. V okviru magistrskega dela smo izvedli biokemijsko in biofizikalno karakterizacijo proteina TEX264. Ker njegova 3D struktura še ni eksperimentalno določena, smo za njeno napoved uporabili program AlphaFold 3, ki je razkril velik delež nestrukturiranih regij in hidrofobno N-končno α-vijačnico. Na podlagi tega smo zasnovali in sintetizirali dve različici proteina: protein TEX264 s celotnim aminokislinskim zaporedjem ter skrajšano različico proteina, $^{∆30}$TEX264, ki ni vsebovala prvih 30 aminokislinskih ostankov. Nobene od različic nismo uspeli pridobiti v topni obliki, zato smo jima dodali fuzijo maltoza vezavnega proteina (MBP). Ta pristop je omogočil pridobitev proteina $^{∆30}$TEX264 v topni obliki. Sledilo je šest izolacij proteina $^{∆30}$TEX264, pri čemer smo postopke postopoma optimizirali. Spremembe so vključevale prilagoditev volumna nosilca (matriksa) pri prvi in drugi Ni-NTA Superflow afinitetni kromatografiji ter preizkušanje različnih velikosti matriksov pri kromatografiji z ločevanjem po velikosti. Prav tako smo preverjali učinek enega oziroma dveh korakov MBP-afinitetne kromatografije ter prisotnosti 0,05 % detergenta Tween-20 v pufrih. Dodatno smo analizirali vpliv količine dodane TEV proteaze na učinkovitost rezanja. Izolacije proteina so predstavljale velik izziv, saj je bilo rezanje s TEV preoteazo neučinkovito. Posledično je bila količina izoliranega proteina nizka, poleg tega pa je vseboval še druge nečistote. Kljub temu smo uspeli pridobiti zadostno količino proteina za izvedbo CD spektroskopije in N-terminalnega sekvenciranja. CD spekter je nakazoval na sekundarno strukturo z zastopanostjo α-vijačnic in β-struktur, kar je bilo v skladu z AlphaFold 3 napovedanim modelom. N-terminalno sekvenciranje je potrdilo pravilno aminokislinsko zaporedje prvih štirih aminokislin proteina $^{∆30}$TEX264. V nadaljnjih raziskavah bi protein $^{∆30}$TEX264 lahko služil kot izhodišče za preučevanje interakcij s proteinom p97 in drugimi adapterskimi proteini, ki sodelujejo pri popravljanju DPC-jev. Takšne raziskave bi prispevale k boljšemu razumevanju mehanizma delovanja proteina TEX264 pri popravljanju poškodb tipa TOP1–DPC.20262026-05-20 15:20:06Magistrsko delo/naloga182674VisID: 25563COBISS_ID: 278994179sl