Karakterizacija heterodimera človeških alfa-aktininov 1 in 4Pavleković, Marko (Avtor) Djinović Carugo, Kristina (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) α-aktininheterodimerizacijafosforilacijaITCNastajanje, razpadanje in organizacijo aktinskih filamentov v celici spremljajo številni aktin vezavni proteini (ABP). Ena izmed skupin ABP so prečni povezovalci aktinskih filamentov, med katere sodi tudi α aktinin. Pri vretenčarjih poznamo štiri izooblike α aktinina. Izmed teh sta dve izoobliki (2 in 3) lokalizirani predvsem v mišičnih celicah, medtem ko sta obliki (1 in 4) prisotni v vseh tipih celic. Vse izooblike tvorijo antiparalelne dimere, tako da se na vsakem koncu dimera nahaja po ena aktin vezavna domena (ABD). Poleg ABD, vsebuje posamezna molekula α aktinina, še osrednjo paličasto domeno in kalmodulinu podobno domeno (CaMD) sestavljeno iz dveh tandemskih ponovitev motiva roke EF (EF1–2 in EF3–4). Razlika med mišičnimi in nemišičnimi izooblikami je med drugim tudi ta, da nemišične α aktinine regulira Ca$^{2+}$, medtem ko je delovanje mišičnih α aktininov neodvisno od kalcija. Poleg kalcija, so nemišični α aktinini regulirani še s cepitvijo s proteazo kalpain, fosfatidil inozitolnimi intermediati in fosforilacijo tirozinskih ostankov. Poleg naštetih načinov regulacije, so pred kratkim ugotovili, da tudi mehanski stres vpliva na delovanje α aktinina, dodatno raven regulacije pa predstavlja tudi tvorba heterodimerov α aktinina-1 in -4. V okviru tega dela smo želeli okarakterizirati nove potencialne načine regulacije delovanja nemišičnih oblik α aktininov. Prvi cilj naloge je bil pripomoči k okarakterizaciji nagnjenosti k tvorbi heterodimerov α-aktinina-1 in -4. V ta namen smo želeli izraziti in izolirati heterodimere α-aktinina-1/-4 preko izražanja z bicistronske RNA. Pri tem smo bili delno uspešni, saj so z uporabo te metode heterodimeri nastajali, vendar nam jih ni uspelo popolnoma očistiti iz mešanice v kateri sta bila prisotna še homodimera posameznih α aktininov. Drugi cilj naloge je bil preučiti dodatna potencialna mesta za post translacijske modifikacije in njihov vpliv na regulacijo delovanja α-aktininov. Pri tem smo najprej preučili proteomske baze podatkov, s pomočjo katerih smo izvedeli kateri aminokislinski ostanki so v celicah v α-aktininu-1 najverjetneje fosforilirani. Za tem smo preverili lokacije teh ostankov v homodimeru α aktinina-1. Na podlagi tega smo se odločili, da bi fosorilacija ostanka S348, zaradi svoje lokalizacije v bližini povezovalne regije med EF1–2 in EF3–4, lahko vplivala na vezavo kalcija in posledično na sposobnost α-aktinina, da prečno povezuje aktinske filamente. Preko uvedbe fosfomimetskih mutacij (S348E in S348D) na to mesto in izotermalne titracijske kalorimetrije (ITC) smo ugotovili, da fosforilacija tega mesta najverjetneje nima vpliva na vezavo kalcija, saj je bila afiniteta vezave kalcija pri mutiranih dimerih podobna afiniteti polovičnih dimerov divjega tipa. Med ITC pa je žal prihajalo do obarjanja proteinov, tako da ti rezultati niso popolnoma nedvoumni.20262026-04-10 14:50:03Magistrsko delo/naloga181657VisID: 22965COBISS_ID: 275378947sl