Vezava modelnega antigena na filamentne bakteriofage s sistemom razcepljenega proteina SnoopTag/SnoopCatcherFekonja, Kaja (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Bozovičar, Krištof (Komentor) nitasti bakteriofagpredstavitev na bakteriofaguSnoopTag/SnoopCatcherNova spoznanja v biotehnologiji so omogočila razvoj naprednih pristopov za ciljno dostavo biomolekul, med katerimi izstopajo rekombinantna cepiva in gensko zdravljenje. Nitasti bakteriofagi predstavljajo obetavno platformo za površinsko predstavitev antigenov, saj omogočajo stabilno vključitev fuzijskih proteinov v kapsidne strukture, kar poveča imunogenost in omogoča učinkovito ciljno dostavo. Zaradi enostavnega genetskega in proteinskega inženirstva ter učinkovite predstavitve antigenov postajajo vse pomembnejši kot dostavni sistemi za rekombinantna cepiva. V magistrskem delu smo za posredno vezavo modelnega antigena na bakteriofagno kapsido uporabili biokonjugacijski sistem SnoopTag/SnoopCatcher, ki temelji na specifični in ireverzibilni tvorbi izopeptidne vezi med komplementarnima fragmentoma domene D4 adhezina RrgA iz bakterije Streptococcus pneumoniae. Tak pristop omogoča natančno in stabilno konjugacijo proteinov brez uporabe kemičnih modifikacij ali dodatnih reagentov, kar je pomembno za ohranjanje biološke funkcionalnosti antigenov. Cilj dela je bil razviti in ovrednotiti platformo za predstavitev antigenov na površini nitastih bakteriofagov z uporabo interakcije SnoopTag/SnoopCatcher. V ekspresijski sev Escherichia coli (E. Coli) NiCo21 (DE3) smo vnesli plazmid pET-28a z genom za fuzijski protein SnoopCatcher- zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). Po izražanju smo rekombinantni protein izolirali in prečistili s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo, njegovo čistost pa ocenili z elektroforezo SDS-PAGE (angl. sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis). Hkrati smo v fagni vektor f88KE vstavili genski zapis za SnoopTag-cMyc v fuziji z genom za kapsidni protein pVIII. Uspešnost konjugacije SnoopTag:SnoopCatcher smo analizirali z SDS-PAGE in prenosom western ter jo potrdili z uporabo protiteles proti cMyc, His in GFP, ki specifično prepoznajo posamezne dele fuzijskega proteina oziroma nastalega konjugata. Kvantitativno oceno konjugacije smo izvedli s kvantitativno analizo luminiscenčnih signalov v primerjavi z referenčnimi proteini znanih množin. Rezultati kažejo, da sistem SnoopTag/SnoopCatcher omogoča stabilno konjugacijo modelnega antigena na površino nitastih bakteriofagov. Takšni fagni konstrukti predstavljajo obetavno platformo za razvoj rekombinantnih cepiv in imunoterapevtskih pristopov ter potencialno tudi za uporabo v biosenzorjih in naprednih metodah molekularne diagnostike.20262026-03-21 08:45:07Magistrsko delo/naloga181000VisID: 124895sl