Zaviranje delovanja Ninjurina-1 z uporabo kratkih protismernih oligonukleotidovKores, Anja (Avtor) Železnik Ramuta, Taja (Mentor) protismerni oligonukleotidiNinjurin-1kloniranje po Gibsonutransfekcijatransformacijarazvoj sistemovluciferazni reporterski sistemtest s propidijevim jodidomELISAkonfokalna mikroskopijacelice HEK 293celice HEK293TmakrofagiNinjurin-1 (NINJ-1) je protein, ki ima v procesu litične celične smrti pomembno vlogo pri poškodbi plazmaleme, pri čemer se iz poškodovanih celic sprostijo s poškodbo povezane molekule (angl. damage-associated molecular patterns, DAMP), ki sprožijo proces vnetja. Zapleti se lahko pojavijo pri bolnikih s kroničnimi vnetnimi boleznimi, pri katerih sproščanje vnetnih molekul DAMP kot posledica uničenja plazmaleme z NINJ-1 prispeva k napredovanju vnetnih bolezni. V nalogi smo želeli razviti nov pristop za zaviranje delovanja NINJ-1. Odločili smo se za uporabo metode protismernih oligonukleotidov (angl. antisense oligonucleotides, ASO), saj z njo dosežemo natančno in specifično tarčno delovanje in se je že izkazala kot varna in učinkovita metoda. V magistrskem delu smo testirali delovanje različnih ASO na zaviranje izražanja NINJ-1 in razvijali različne sisteme, s katerimi bi lahko delovanje ASO ovrednotili. S testom živosti s propidijevim jodidom smo dokazali, da prekomerno izražanje NINJ-1 sproži celično smrt v celični liniji HEK293T. Delovanje petih različnih ASO smo preizkusili z dvema različnima pristopoma – najprej smo razvili sistem z luciferaznim reporterjem, nato pa še sistem, ki temelji na določanju deleža celične smrti s propidijevim jodidom. Preizkušeni ASO niso znižali izražanja NINJ-1. V sklopu naloge smo razvijali še tri dodatne pristope za vrednotenje delovanja protismernih oligonuklotidov na izražanje NINJ-1. Ugotovili smo, da posrednih učinkov ASO na izražanje NINJ-1 ne moremo spremljati na podlagi aktivacije z vnetjem povezanih promotorjev, ki se odzivajo na vnetne dejavnike, medtem ko lahko spremembe v izražanju NINJ-1 posredno spremljamo preko vnetnih citokinov, ki jih izločajo imunske celice, ki so v stiku s celicami, ki izražajo NINJ-1.20262026-01-28 07:15:17Magistrsko delo/naloga178447VisID: 278694COBISS_ID: 266523651sl